小果型西瓜子葉節離體培養

徐洪國，宣 楊，仲娟娟，王英學，祁宏英

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 黑龍江齊齊哈爾 161006）

中國作為西瓜的生產和消費大國，產量占世界總產量的60%以上[1]。隨著人民生活水平的提高，居民家庭結構和飲食習慣的改變，人們對外觀靚麗、品質優良、攜帶方便的小果型西瓜的需求日益增加，小果型西瓜種植面積和種植效益也在逐年增加。但是，西瓜遺傳基礎狹窄，種質資源缺乏，很多重要的性狀無法通過常規育種方法進行改良。因此采用生物技術手段進行種質創新，培育優質、高產的抗病新品種已成為西瓜遺傳育種研究的熱點。植物組織培養技術作為生物技術的重要組成部分，越來越受到人們的關注。近年來西瓜離體培養技術己經被廣泛用于離體快速繁殖[2]、基因的遺傳轉化[3-6]和誘導變異[7]等方面。高效組織培養和植株再生技術的建立是西瓜在生物技術研究領域的基礎，西瓜子葉節無菌體系一般是通過種子去殼后在無菌條件下萌發而獲得無菌苗，切取無菌苗子葉節誘導不定芽的方法而建立的。

前人已經在西瓜組織培養和植株再生方面進行了研究，但是，小果型西瓜自交品系K1由于種子較小，胚發育不良，在組織培養過程中存在出芽率低、污染率高、子葉節再生率低等問題，為了進一步探索小果型西瓜組織培養技術，以期建立小果型西瓜自交品系K1的組織培養和植株再生流程，筆者系統研究了小果型西瓜種子無菌萌發的條件及植物生長調節劑對子葉節再生不定芽的影響，為進一步完善西瓜再生體系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用小果型西瓜自交品系‘K1’為試驗材料，西瓜種子由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院園藝試驗室提供。試驗于2016年7—12月在齊齊哈爾大學生命科學與農林學院園藝植物組織培養室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子的處理 種子的處理方式如表1：（1）先浸種0、6、12 h 再分別用 0.1%升汞浸泡5、10、15 min；（2）3%（ω，下同）NaClO 浸種20 min后直接培養；（3）3%NaClO 浸種 20 min 后再浸種 6、12 h，然后再用3%NaClO消毒20 min。

表1 種子處理方式

1.2.2 種子的離體萌發 將西瓜種子去殼消毒后接入不同無菌苗誘導培養基上。無菌苗誘導培養基為 MS，1/2 MS、1/4 MS和 1/8 MS(含庶糖 30%，瓊脂0.9%)。先進行3 d的暗培養，之后再進行光培養，觀察其生長情況。

1.2.3 子葉節外植體的獲取和培養 在無菌條件下選取苗齡5～7 d的西瓜無菌苗，切取子葉節，子葉節基部插入培養基。以MS為基本培養基，蔗糖30%，pH 5.8，用0.9%瓊脂。設置不同培養基，誘導子葉節產生不定芽。

2 結果與分析

2.1 不同處理對西瓜種子萌發的影響

由表2可知，用不同的方式處理種子對種子的萌發率影響較大，浸種6 h有助于提高種子的萌發率，在浸種之前對西瓜種子帶皮進行表面消毒處理可以顯著減少污染率。本研究中，小果型西瓜種子最佳浸種及消毒滅菌方式為先用3%NaClO消毒20 min，無菌水浸種6 h，然后用70%酒精消毒60 s，再用3%NaClO消毒20 min，最后用無菌水清洗3次每次1 min。

2.2 不同培養基對西瓜種子萌發的影響

由表3可知，不同培養基對小果型西瓜種子萌發的影響很大，雖然西瓜種子在4種培養基上均能萌發，但在1/8 MS培養基上的萌發率最高，達到94.1%，而且萌發迅速，幼苗生長健壯。

表2 不同處理對種子萌發及污染的影響

表3 不同培養基對西瓜種子萌發的影響

2.3 不同質量濃度激素配比對西瓜子葉節不定芽誘導的影響

將外植體分別接種于不定芽誘導培養基中培養，比較不同生長激素對不定芽誘導的影響，其結果如表4。經過2周時間左右，絕大部分子葉的切口處都會生長出綠色的小芽。由表4可知，這些不定芽誘導培養基全部都可以誘導出不定芽，但是其誘導結果卻大不相同，其中，在MS培養基中附加BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的激素配比的不定芽誘導率在本試驗中最高；而其他的激素配比都是不如甚至相差很大。有上述的試驗結果表明，西瓜子葉節誘導不定芽的最佳培養基為MS培養基中附加 BA2.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1。

表4 不同處理對西瓜子葉節不定芽誘導的影響

3 討論與結論

3.1 西瓜無菌苗的獲得

小果型西瓜由于種子較小，胚發育不良，含內源菌[8]等原因，在組織培養過程中存在出芽率低、污染率高、種子發芽不整齊甚至喪失發芽能力等問題較為突出，本試驗從多方面研究了小果型西瓜種子浸種與消毒滅菌的影響因素。因為西瓜的種皮比較堅硬[9]，所以要在種子發芽之前要對種子進行浸泡處理，一般浸泡6 h左右對發芽率的提高最有利，在浸種之前對西瓜種子帶皮進行表面消毒處理可以顯著減少污染率，這可能是由于在浸種之前對種子進行表面消毒可以減少外部細菌的滲入。

3.2 西瓜子葉節不定芽的誘導

在進行西瓜子葉節的再生培養時，子葉節的愈傷組織誘導率達到100%，然后從愈傷組織中誘導出不定芽。因此，子葉節作為外植體可以通過愈傷組織途徑，誘導愈傷組織后再進一步分化形成再生植株。激素是誘導外植體產生不定芽的重要因素之一。不同的激素類型和濃度配比對不定芽影響明顯。很多學者對此也進行了研究。研究結果均為一定濃度的6-BA是誘導西瓜外植體分化所必須的激素，附加低濃度的IAA、IBA或者NAA則有利于不定芽的誘導分化，但是不同基因型的西瓜不定芽誘導率存在一定的差異[10-16]。本研究結果表明，生長素與細胞分裂素的組合在促進西瓜子葉節不定芽誘導方面起著重要的作用，從本試驗的結果可以看出，通過設置不同的濃度配比最終選擇出最適合誘導西瓜不定芽的激素配比。本研究中當BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的配比能使小果型西瓜自交品系‘K1’不定芽的誘導率達到最高達到70.1%。

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