淺談生物種質資源保存技術和方法

王立輝

（西藏自治區高原生物研究所，西藏 拉薩 850008）

1 植物種子保存技術

1.1 技術原理

種子保存采用國際生物多樣性組織推薦的種子保存方法，即在相對濕度10-15%和10-20℃的溫度下將種子干燥至水分含量5%左右，然后將種子密封在容器內（以保持它們的水分含量），儲藏在-18℃或更低的溫度下［2-3］。

1.2 技術路線

種子保存的技術主要步驟包括種子的采集（采集、記錄、標本收集等）、前期處理（初步干燥、清除雜物，包括去果皮、果翅、壞空種子等）、干燥、入庫保存、庫存種子活力檢測、復壯等，并包括所有有關數據的錄入和處理等。

具體步驟：制定采集計劃/尋求有關方面的許可、野外采集、迅速運送種子回庫、采集數據的計算機錄入、初步干燥（15%相對濕度，15℃＞1周）、清理、X-光射線分析、切割試驗、種子數量測定、主要干燥（10%相對濕度，18℃＞4周）、封裝/入庫、初始活力檢測、種名證實、送出復份樣品、種子的分發、活力復測與復壯（每5年或10年1次）。

2 植物離體保存技術

2.1 技術原理

植物離體保存，是植物種子保存的補充，主要保存對象是種子頑拗型植物、多年生一次性開花植物、多漿植物，其它難以用種子保存的植物，以及采用離體保存比用種子保存更經濟有效的植物。例如蘭科、天南星科、棕櫚科、百合科、龍舌蘭科、仙人掌科、杜鵑花科、薯蕷科、景天科、龍膽科以及蕨類植物，大多將采用離體保存的方式進行長期有效的保存。植物離體材料是可供繁殖使用的非種子材料，包括試管苗、愈傷組織、塊根、根孽、塊莖、鱗莖、球莖、插條、珠芽、芽、不定芽、芽條、花粉、花藥、孢子及其它微繁殖體或培養物。

植物離體材料保存方法主要是常低溫保存法、冷凍保存法和-196℃的液氮罐保存法。對于大部分植物離體材料而言，主要采用常低溫保存法，而且更新的周期較短，因此，需要設置全自動溫室，保證植物離體材料的定期更新。

植物組織培養等生物技術是植物離體保存所采用的主要技術手段，細胞水平和分子水平的手段也是植物離體保存的常規技術。

2.2 技術路線

植物離體種質資源的保存，主要的技術路線：材料的準備（選擇適宜的年齡與生長狀態）、預處理（如預培養或低溫鍛煉）、將材料裝入試管（插入冰浴中0℃）、加入0℃預冷的冰凍保護劑、慢速（1℃/min）降溫到-30℃至-40℃、液氮保存、37℃至40℃水中快速化凍、TTC（檢測細胞活力）或再培養、觀測（恢復生長速度、生長量、存活率、植株再生、遺傳性狀分析）。

3 微生物種質資源保存技術

3.1 技術原理

微生物種質資源保存技術主要用于長期、安全、有效地保存大型真菌種質資源，同時適當保存一定數量的放線菌和特殊生境微生物。

在微生物菌種的收集保存中，應根據物種的特性，采用多種保存方法，取長補短，以達到長期、安全、有效地保存種質資源目的。常用的方法有菌種轉接法、礦物油保存法、凍干法和液氮保存法等［4］。

3.2 技術路線

技術路線包括微生物種質采集、分離、純化、分類鑒定、入庫保存，定期進行菌種的復壯及活力檢測，并建立相應數據庫等。具體技術路線詳見圖1。

圖1 微生物種質資源保存技術路線

4 動物種質資源保存技術

4.1 技術原理

動物種質資源主要以保存珍稀瀕危特有的野生動物種質資源（精液、卵細胞和胚胎細胞）為主，野生近緣種和特種經濟動物的種質資源為輔。有些野生動物的種質資源非常難以收集，這時可以先收集野生動物的組織（特定組織的細胞系或生殖細胞），對組織材料進行低溫保存，同時可以對組織細胞建立細胞系或株。動物種質資源以深低溫液氮保存為主，作為暫時保存，也可考慮用－80℃冰箱保存［5］。

4.2 技術路線

主要技術路線包括采集、檢測活力、降溫（不同種質材料選用不同的防凍劑和防凍模式）、液氮保存、定期復蘇及活力檢測，并在信息系統中輸入相應的數據和信息。

采用非損傷性方法，采集不同的動物種質材料，通過液氮深低溫冷凍保存方法，長期保存動物種質資源。對不同的種質材料，應采用不同的方法來采集和保存。用注射器抽取血樣，全血低溫保存；采用耳部打孔辦法，采集皮膚樣品，建立成纖維細胞，液氮保存；采用電刺激或假陰道法采集精液，用非手術方法采集卵細胞，以合適的防凍液處理，液氮保存。

具體步驟：制定采集、申請許可、野外捕獲動物、樣品采集(皮膚、血液、生殖細胞）、樣品迅速運送到中心庫、質量檢查、數據錄入、樣品入庫、細胞系建立、低溫保存、定期質量控制、樣品復份保存、樣品的分發和相關研究開發。

5 DNA種質資源保存技術

5.1 技術原理

由于DNA材料的量很小，將采用-80℃的低溫冰箱或液氮儲藏的方法［6］。

DNA種質資源保存庫主要保存無法通過種子庫、離體庫或微生物種質資源庫保存的生物種質材料。DNA的提取、純化，在收集到組織材料后分步實施。

5.2 技術路線

總DNA保存步驟：種質材料、提取總DNA、檢測DNA的純度及大小、冷凍干燥、-80℃保存/液氮罐。

［1］呂植.西藏生物多樣性保護與管理［M］.北京：中國林業出版社，2000：1-2.

［2］張峰，張教洪，閆樹林，等.藥用植物種質資源保存技術規程［J］.種子，2012，31（9）：69－70.

［3］文彬.植物種質資源超低溫保存概述［J］.植物分類與資源學報，2011，33（03）:311-329.

［4］寧國贊.我國農業微生物種質資源收集保藏利用現狀及發展前景［A］.第九屆全國土壤微生物學術討論會論文摘要［C］.全國土壤微生物學術討論會，2001，5.

［5］燕海峰，肖兵南，等.家禽種質資源保存研究［J］.畜禽業，2003（08）:21-23.

［6］房經貴.DNA保存在果樹種質資源保存中的利用策略［A］.中國園藝學會.中國園藝學會第四屆青年學術討論會論文集［C］.中國園藝學會，2000:5.