佳樂麝香對蘿卜種子發芽及DNA損傷的生態毒理影響

姜麗思，張倩茹，王建美，李斯雯，宋婕,3，崔偉娜，劉宛

1. 中國科學院沈陽應用生態研究所 污染生態與環境工程重點實驗室，沈陽 110016 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 遼寧大學環境學院，沈陽 110036 4. 上海應用技術學院，上海 201418

佳樂麝香(HHCB)是一種典型的半揮發疏水性多環類人工合成麝香[1]，具有特殊的香味、良好的提香和定香能力以及價格低廉等優點，現已作為工業香料被廣泛地應用于日用化工產品，如香水、面霜、洗發水、沐浴露、柔順劑、肥皂和洗衣粉等[2]。由于被大量使用，HHCB被持續不斷地釋放到環境中，所產生的生態風險已引起各國政府及學界的高度重視[3]。已有研究表明，HHCB極易通過食物攝入、吸入吸收和皮膚接觸等途徑進入人和動物體內，抑制細胞抵御化學物質的能力，并在體內蓄積進而導致潛在危害[2-4]。毒理學研究也表明，其對水生生物具有亞急性毒性、弱的雌激素作用與抗雌激素效應，以及發育毒性和內分泌干擾等效應[5-7]。HHCB能夠通過污水灌溉、污泥農用、大氣沉降和垃圾填埋等多種途徑進入并積累于環境中，從而提高其對生物的脅迫水平。目前，針對HHCB的研究主要集中于水體、沉積物和污泥中的分布特征[8-9]，對其毒性效應的研究多局限于水生生態系統，大部分也是針對水生植物、魚類等細胞毒性測試[10]，而對于陸生植物基因組DNA損傷方面的研究工作鮮有報道。

隨機引物擴增多態性(Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD)技術是美國學者Williams和Welsh于1990年首先創立的，該技術是利用隨機引物對目的基因組DNA進行PCR擴增，并分析擴增產物DNA多態性的一種DNA分子標記技術[11-12]。由于其具有操作簡單、通用性好、靈敏度高等優點，RAPD技術被廣泛應用于遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、土壤酶活性、微生物群落結構分析等生物學領域[13]。在生態毒理學研究中，RAPD技術多以人和動物為研究對象[14-17]，近年來才逐漸應用于植物，例如，研究逆境脅迫下植物的基因突變[18-20]，檢測污染物對植物脅迫造成的DNA損傷，包括DNA加合物、插入缺失、斷裂、堿基置換等[20-23]。目前，利用RAPD技術已成功檢測出重金屬、雌激素、多環芳烴、農藥等多種污染物脅迫條件下對細胞DNA造成的損傷和突變[31-33]。因此，本研究選用RAPD技術來探究不同濃度HHCB脅迫是否能夠對大田作物蘿卜基因組造成DNA損傷，以期為農田污染生態毒理學診斷提供快速靈敏的生物標記物，為制定農田污染安全預警標準提供理論依據和方法指導。

本研究選用大田常見作物十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus L.)為受試植物，通過發芽實驗以及RAPD分析，研究HHCB對蘿卜發芽率、芽伸長、根伸長及DNA損傷的影響，探究各項表觀生長指標和基因組對HHCB脅迫的敏感程度，分析脅迫造成的DNA損傷狀態，并通過不同濃度處理間的遺傳相似性比較，篩選出可用于檢測HHCB遺傳毒性效應的敏感生物標記物，為農業實踐提供理論和方法學指導。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　儀器與試劑

主要儀器：分子凝膠成像系統(BIO-RAD，美國)；小型臺式高速離心機(Eppendorf，德國)；植物培養箱(Panasonic，日本)；PCR儀(Biometra，德國)；核酸蛋白測定儀(Eppendorf，德國)。

主要試劑：佳樂麝香(50%鄰苯二甲酸二乙酯溶液，北京祥云興業科技有限公司)；新型植物基因組DNA提取試劑盒(北京康維世紀生物科技有限公司)；LA Taq(TaKaRa，日本)；dNTP Mixture(TaKaRa，日本)；DL2000 DNA Marker(TaKaRa，日本)；Agarose Regular(TaKaRa，日本)；30%過氧化氫(北京博艾遠上生物科技有限公司)。

1.2　種子萌發實驗

1.2.1實驗方法

根據預實驗結果及相關文獻，設置HHCB濃度為0、5、10、25、50 mg·L-1[28]，每個處理設置3個平行。全部實驗均在無菌條件下操作。實驗前，每個培養皿放置25粒飽滿、均勻的蘿卜(Raphanus sativus L.)種子(購自于沈陽農業大學種子站)，用3%過氧化氫溶液消毒5 min，以避免微生物等原因對種子萌發的影響；再用ddH2O沖洗3次，以清除殘留過氧化氫。在無菌培養皿中平整地放入2層濾紙，分別加入5 mL不同濃度的經超聲震蕩制備均勻的HHCB懸濁液，并用封口膜沿皿壁密封，以防止HHCB的快速揮發及保持相對一致的呼吸和無菌環境。將培養皿放置在(25 ± 1) ℃的光照培養箱中黑暗培養5 d，對芽長大于2 mm的蘿卜幼苗進行計數及根長與芽長的測量，并計算各處理組種子發芽率、根伸長抑制率和芽伸長抑制率。

1.2.2數據分析

發芽率計算：發芽率=發芽種子數/種子總數 × 100%

根伸長(或芽伸長)抑制率計算：抑制率=(1-處理/對照) × 100%

數據采用SPSS 23.0進行處理，結果以平均值±標準差表示；利用單因素方差分析中的 LSD多重比較檢驗不同處理間的結果差異顯著性：P < 0.05為差異顯著，P < 0.01為差異顯著。

1.3　DNA損傷實驗

1.3.1實驗方法

實驗材料的培養與處理同1.2.1，將相同處理的蘿卜幼苗根尖(1～2 cm)進行混合，按照試劑盒說明書提取幼苗全基因組DNA，所得DNA用核酸蛋白測定儀檢測其純度及含量，根據測定結果，上樣100 ng DNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用DL2000 DNA Marker進行含量校準，再進行分裝，于-20 ℃保存備用。

參照Liu等[20-21]方法進行RAPD分析，對PCR條件略做優化，從GC含量較高(50%～60%)，一般為9～10個寡核苷酸的12條隨機引物中篩選出4條能夠獲得清晰條帶，重復性好的引物P3、P9、P10、P11(表2)。隨機引物擴增反應體系(25 μL)如下：2.5 μL 10 × PCR Buffer，0.2 mmol·L-1dNTP Mixture，1 U LA Taq DNA聚合酶，0.5 μmol·L-1引物，80 ng DNA模板，并用ddH2O補足體系。PCR條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性60 s，38 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環35次，72 ℃延伸10 min。每次PCR反應均設3～4個重復，并取5 μL PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以驗證RAPD可重復性。再將驗證結果良好的PCR產物用5%半變性聚丙烯酰氨凝膠(含50%尿素)電泳檢驗，銀染顯色并拍照記錄電泳結果。

1.3.2數據分析

電泳圖譜使用Image Lab(Bio-Rad)軟件對重復性好的條帶(包括亮帶和可識別的暗帶)進行分析，每一個條帶為一個標記，代表一個引物的結合位點。根據各個分子標記的遷移率及其有無統計數據，若有條帶(包括清晰條帶、可識別弱帶)出現記作“1”，同一位置沒有條帶記為“0”。應用Microsoft Excel 2010建立各引物不同濃度間的“0、1”數據庫，統計不同脅迫濃度下擴增出來的總條帶數和多態性條帶數。

表1　佳樂麝香(HHCB)的基本理化性質Table 1　Physiochemical properties of galaxolide (HHCB)

各引物的多態性條帶百分率(percentage of polymorphic bands, PPB)計算：

PPB=(多態位點數/位點總數) × 100%

基因組模板穩定性(GTS)計算：GTS= (1-a/n) × 100%。式中，a為處理組幼苗根尖的RAPD多態性條帶數；n為對照組的總條帶數。多態性條帶數為與對照組相比，處理組出現的和消失的PCR條帶數的總和[29]。

用NTSYS 2.10軟件計算遺傳相似性系數(Genetic similarity，GS)，采用UPGMA方法進行聚類分析，構建遺傳相關聚類圖。

圖1　HHCB對蘿卜發芽率的影響注：字母不相同表示各處理組之間差異顯著(P < 0.05)，下同。Fig. 1　Effects of HHCB on the germination rate of Raphanus sativus L.Note: Values with different letters are significantly different from each other (P < 0.05). The same below.

2　結果(Results)

2.1　HHCB對蘿卜種子表觀生長指標的影響

2.1.1對發芽率的影響

從圖1和圖2A可以看出，當HHCB脅迫濃度低于25 mg·L-1時，蘿卜發芽未受到顯著影響(P > 0.05)，發芽率基本維持在86.7%～90.7%；當HHCB脅迫濃度達到50 mg·L-1，甚至更高時(100 mg·L-1)，蘿卜發芽受到顯著抑制(P < 0.05)作用，發芽率分別為56%和28%。這表明蘿卜種子的發芽率與HHCB脅迫濃度之間存在明顯的劑量-效應關系，HHCB的存在與否及濃度高低能夠對蘿卜種子萌發產生顯著的生理生化反應，最終降低種子萌發率，甚至產生嚴重的抑制效果。

表2　RAPD實驗所用隨機引物序列Table 2　Sequences of 12 primers used in the RAPD experiment

圖2　HHCB對蘿卜生長的影響Fig. 2　Effects of HHCB on the growth of Raphanus sativus L.

2.1.2對蘿卜根長和芽長的影響

從圖2B和圖3可以看出，HHCB對蘿卜根及芽的生長具有明顯的抑制作用。隨著HHCB的濃度從0增加至100 mg·L-1，蘿卜的根長從10.15 cm顯著縮短至2 cm以下，芽長從4.66 cm縮短至1 cm以下。特別是當HHCB濃度超過25 mg·L-1時，蘿卜根長和芽長已不及對照組的二分之一，根長分別為1.69 cm和0.61 cm；芽長分別為1.15 cm和0.34 cm。

圖3　HHCB對蘿卜根長和芽長的影響Fig. 3　Effects of HHCB on the root and shoot length of Raphanus sativus L.

圖4　HHCB對蘿卜根伸長和芽伸長抑制率的影響Fig. 4　Effects of HHCB on the inhibition rates of root and shoot elongation of Raphanus sativus L.

2.1.3對蘿卜根伸長和芽伸長抑制率的影響

由圖4可知，HHCB在5～100 mg·L-1的濃度范圍內，蘿卜的根伸長和芽伸長抑制率均隨污染物濃度增加而呈現上升的趨勢。特別是當HHCB濃度達到100 mg·L-1時，蘿卜的根伸長和芽伸長抑制率非常接近，達93.00%左右。回歸分析表明(表3)，線性和對數方程均可以很好地擬合根伸長和芽伸長抑制率與HHCB濃度之間的關系，特別是芽伸長抑制率與HHCB濃度呈現顯著正相關(R2=0.91)，可以明顯表征HHCB對蘿卜的脅迫效應。采用SPSS 23.0 統計軟件中Probit回歸計算出HHCB對蘿卜根長和芽長的EC50分別為13.76 mg·L-1和21.66 mg·L-1, 這表明蘿卜根系較芽對HHCB脅迫更為敏感。

2.2　對蘿卜幼苗DNA損傷的影響

2.2.1對根尖基因組DNA含量的影響

提取的蘿卜幼苗根尖全基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰整齊，無雜質污染和降解(圖5)，且A260/A280比值均在1.8～2.0之間，說明提取的DNA質量較好，符合RAPD的分析要求。對不同樣品DNA含量檢測也發現，HHCB能夠顯著抑制蘿卜幼苗根尖DNA的產生(圖6)。與對照組相比，隨著HHCB濃度的增加，DNA含量顯著降低，從116.4 μg·g-1降低至76.38 μg·g-1(50 mg·L-1處理組)；而100 mg·L-1處理組蘿卜發芽量及根長量不足，不能進行全基因組DNA提取。特別當HHCB濃度從0增加至25 mg·L-1，DNA含量基本呈線性降低，此后下降略微緩慢。這表明HHCB的脅迫使蘿卜幼苗根尖基因組DNA發生斷裂降解，且隨著脅迫濃度的增加，基因組DNA降解程度增加，甚至其合成也受到顯著抑制，使其含量處于較低水平。

表3　HHCB濃度與根伸長和芽伸長抑制率的擬合方程Table 3　Fitted equations between the concentrations of HHCB and the inhibition rates of root and shoot elongation of Raphanus sativus L.

圖5　蘿卜根尖基因組DNA電泳圖注：M為DL2000 DNA marker；1～5分別表示HHCB的不同脅迫濃度(0、5、10、25、50 mg·L-1)。Fig. 5　Electrophoretogram of the genomic DNA in the seedling roots of Raphanus sativus L.Note: Lane M is DL2000 DNA marker. Lane 1 to 5 represent the different concentrations of HHCB (0, 5, 10, 25 and 50 mg·L-1).

圖6　HHCB對蘿卜根尖全基因組DNA含量的影響Fig. 6　Effects of HHCB on the contents of the genomic DNA in the seedling roots of Raphanus sativus L.

圖7　蘿卜根尖基因組RAPD電泳圖注：M為DL2000 DNA marker; 1～5分別表示HHCB的不同脅迫濃度(0、5、10、25、50 mg·L-1)；A～D分別表示不同引物 P3、P9、P10、P11。Fig. 7　Electrophoretogram of the genomic RAPD in the seedling roots of Raphanus sativus L.Note: Lane M is DL2000 DNA marker. Lane 1 to 5 represent the different concentrations of HHCB (0, 5, 10, 25 and 50 mg·L-1). Letter A to D represent the primers of P3, P9, P10 and P11.

2.2.2對根尖基因組DNA損傷的影響

選用4條能夠獲得清晰條帶、重復性好的RAPD引物對蘿卜根尖基因組DNA進行PCR擴增。從圖7可以看出，4條引物均擴增出特異性強且穩定性較好的PCR產物。所得擴增條帶的相對分子量集中在500～2 150 bp之間。各處理組蘿卜根尖基因組DNA的RAPD圖譜在數目、位置及熒光強度上均發生了明顯的變化，表明在此PCR條件下的擴增效果較為理想。利用Image Lab軟件對RAPD圖譜的條帶數量進行統計分析。由表4可知，在5 mg·L-1時，DNA多肽率和基因組模板穩定性(GTS)均為對照的50.0%，即HHCB脅迫導致蘿卜根尖基因組DNA損傷的最低觀察效應濃度為5 mg·L-1。由此可見，低濃度的HHCB脅迫就足以對蘿卜根尖基因組DNA造成嚴重損傷，且隨著HHCB處理濃度的增加，DNA多態率增加，基因組模板穩定性(GTS)減小。這些都表明HHCB能夠造成植物嚴重的DNA損傷，對基因組的穩定性產生較大影響。

對RAPD電泳圖譜進行分析，計算不同處理組間的遺傳相似性系數，采用UPGMA法構建遺傳關系聚類圖(圖8)。結果顯示，處理組間的遺傳相似性系數變化范圍在0.59～0.72之間，遺傳多樣性存在一定的差異。5個不同濃度處理組在遺傳相似性系數0.65的位置上可分為3類：對照組和高濃度組(50 mg·L-1)各為一類，中低濃度組(5、10、25 mg·L-1)歸為一類；而處理組在遺傳相似性系數0.72的位置上可分為3類：低濃度組(5和10 mg·L-1)為一類，中濃度組(25 mg·L-1)為一類，它們之間的相似性系數最大為0.72。5和10 mg·L-1處理組間的遺傳相似性系數高于25和50 mg·L-1處理組間的相似性系數，表明HHCB的濃度對受試植物的遺傳多樣性具有顯著影響，隨著化學品濃度的升高，DNA損傷程度增大，遺傳相似性變遠。

圖8　不同處理組間聚類分析圖Fig. 8　Dendrogram of cluster analysis for different treatments

處理濃度/(mg·L-1)Treatmentconcentrations/(mg·L-1)條帶數量NumberofbandsP3P9P10P11條帶總數Totalbands基因組模板穩定性/%GTS/%多肽率/%PPB/%02415302998100.00.051778174950.050.01020711215939.860.22517912236137.862.25022109226335.764.3

3　討論(Discussion)

在以植物作為模式生物的生態毒理學評價中，經常使用較為容易獲得的表觀生長指標，如發芽率、根長、芽長或生物量等來考察污染物的生態毒性效應[30]，雖然這可以在一定程度上簡便、快速地評價污染物毒性，但往往也忽略了很多潛在的毒性風險。從本研究中，我們可以清晰地觀察到HHCB在一定濃度范圍內(5～25 mg·L-1)對蘿卜發芽無顯著性影響，而陳蘇等[28]的研究顯示，一定濃度的HHCB(50～150 mg·kg-1)對小麥(Triticum aestivum)發芽有促進作用。研究人員認為[28]，這是由于HHCB所具有的類雌激素作用所導致的，低劑量HHCB可以使某些中毒植物細胞產生興奮效應，進而在一定程度上刺激植物生長。雖然污染物同為HHCB且濃度相近，但對于不同的受試植物，發芽效應所表現出的敏感程度卻不盡相同。此外，我們還發現HHCB對蘿卜的根伸長抑制率明顯高于芽伸長抑制率，這與范飛等[31]研究麝香酮對小麥種子發芽和根伸長的毒性效應結果一致，即亦顯示麝香酮脅迫小麥的根長抑制率明顯大于芽長抑制率。本研究中，蘿卜種子發芽、根伸長、芽伸長對HHCB的敏感度依次為：根伸長>芽伸長>發芽率，這與Liu等[32]提出的植物種子發芽相關各項指標的敏感度順序一致，而這一現象可能與種子發芽和根、芽伸長的生長過程有關。種子發芽所需能量主要來自于胚內養分的供應，所以外源污染物對種子芽長的影響在一定濃度下表現得不是很明顯，只有當外源污染物達到一定濃度時，種子的發芽過程才會被抑制。根據宋玉芳等[33]的研究，小麥種子發芽對有機污染物的敏感度較重金屬強，而且在根系的受害癥狀與受害機制上都存在明顯的差異。植物受到重金屬(Cu、Pb、Zn、Cr)脅迫后，僅僅是根伸長受到抑制，沒有其他明顯的受害癥狀；而本研究中，植物受到新型污染物HHCB脅迫后，不僅根伸長受到抑制，芽伸長也受到明顯的抑制。且當HHCB濃度較高時，蘿卜的根和芽均有矮化變粗的現象(圖2)，這與范飛等[31]的研究結果一致。有研究表明，有機污染物的生態毒性不僅與其濃度有關，還可能與它的其他化學特性及其對靶標生物的毒性機制有關[31]。水培實驗中，蘿卜幼苗的根從一開始就直接浸入到溶液中，其生長和發育全過程均通過根系來直接接觸外源污染，因而根部對污染物的脅迫響應更直接，更敏感。本研究結果是在水培條件下獲得的，干擾因素相對較少，更適宜研究單純污染物對生物的影響；而在土壤環境中存在諸多能夠影響HHCB化學性質的因素，因此水培實驗所獲得的結果更有利于污染物作用機制的研究，也必然與土培條件下的結果存在一定差異。

生物基因組DNA是遺傳信息的載體，具有良好的穩定性。環境污染物可以誘導生物體細胞內發生DNA損傷和突變，從而導致引物結合位點的核苷酸增加或缺失，并最終影響DNA片段的圖譜形態[29]。張義賢等[34]和齊雪梅等[35]的研究均發現，Cu可造成谷子、大麥和玉米基因組DNA的多態性增加，增加量與Cu濃度存在劑量-效應關系。Mengoni等[36]的研究表明，Cu污染可以導致奇異花瓶草(Silene paradoxa L.)RAPD譜帶的增加，且增加的2條譜帶為Cu污染所特有的。解莉婧等[37]、詹振楠等[38]和劉宛等[39]的研究指出，Cd可造成蠶豆(Vicia faba)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和大麥(Hordeum vulgare)RAPD譜帶的增加、缺失及熒光強度的改變，且基因組模板穩定性下降。本研究結果與上述現象類似，在HHCB脅迫條件下，蘿卜幼苗根尖DNA含量明顯降低，基因組模板穩定性下降，且有4條隨機引物擴增得到的RAPD電泳圖譜顯示出明顯的差異，即條帶的減少或增加、熒光強度的減弱或增強。這些都表明HHCB脅迫對蘿卜造成了非常嚴重的DNA損傷。而造成蘿卜根尖基因組DNA損傷的可能原因如下：(1)由于基因組重排引起了寡核苷酸引發位點變化；(2)由于HHCB脅迫誘導了生物體細胞內與引物結合位點的DNA片段的斷裂、插入、缺失或堿基突變等，使引物無法與結合位點匹配，進而引起DNA構象的改變，呈現出多態性，形成了新的RAPD電泳圖譜[40-41]；(3)由于在多拷貝引物結合位點上，某些位置的堿基發生了突變，導致結合量增加或減少，擴增的DNA量也隨之變化，使RAPD譜帶強度變化[42]，最終導致幼苗根尖基因組模板的穩定性下降；(4)幼苗根尖細胞內的DNA聚合酶與受損傷的DNA相互作用，這些過程可能會降低或阻止PCR反應中旁路DNA片段的聚合。旁路聚合反應是非常復雜的過程，與DNA聚合酶活性、損傷DNA的結構及其序列等因素有關[39]。聚類分析結果表明，不同濃度HHCB處理組間遺傳多樣性存在一定的差異，HHCB的濃度對受試植物的遺傳多樣性具有一定的影響，且隨著其濃度的升高，DNA損傷程度增大，其遺傳相似性變遠(圖8)。該結果與蘿卜幼苗的發芽生態毒性指標(發芽率、根伸長和芽伸長抑制率等)相一致，即HHCB對蘿卜幼苗生長的顯著抑制作用與其RAPD電泳圖譜的變化之間存在良好的相關性，說明幼苗根尖大多數細胞中DNA損傷程度可能比較嚴重，HHCB亦影響基因組模板的穩定性。因此，利用RAPD分析植物DNA多態性變化可作為檢測HHCB污染的敏感生物標記物。

此外，有研究也表明，HHCB污染脅迫能夠引起蚯蚓體內活性氧自由基累積、脂質過氧化并導致內質網損傷[3]。而細胞內的活性氧若不及時清除，會對機體造成氧化脅迫，可與蛋白質、核酸和脂類作用，進而引起DNA損傷、酶失活、膜脂過氧化作用，甚至細胞死亡[43]。這可能是由于ROS幾乎雜亂地與細胞內的組分發生反應[44]，破壞蛋白質的結構，引起DNA斷裂、降解及修飾，從而影響了DNA復制，進而造成DNA損傷。尹冬雪等[45]的研究表明：多環芳烴(PAHs)對擬南芥(Arabidopsis thaliana)的毒害主要是某種自由基的產生引發了氧化脅迫作用。HHCB是一類典型的疏水性有機污染物，與多環芳烴的理化性質具有一定的相似性，因此其所引起的毒害效應可能與多環芳烴相似，即HHCB通過對細胞造成氧化脅迫作用，進而引發一系列的生理生化毒性效應。為了深入探討HHCB的生態毒性效應，有必要在分子水平上進一步明確其具體作用機制，探究在氧化脅迫中占主導因素的自由基類別，及HHCB脅迫誘導蘿卜關鍵基因的響應機制和產生氧化脅迫的具體過程。

參考文獻(References)：

[1]Balk F, Ford R A. Environmental risk assessment for the polycyclic musks, AHTN and HHCB : II. Effect assessment and risk characterisation [J]. Toxicology Letters, 1999, 111(1-2): 81-94

[2]周啟星, 王美娥, 范飛, 等. 人工合成麝香的環境污染、生態行為與毒理效應研究進展[J]. 環境科學學報, 2008, 28(1): 1-11

Zhou Q X, Wang M E, Fan F, et al. Research progress in environmental pollution, ecological behavior and toxicological effects of synthetic musks [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, 28 (1): 1-11 (in Chinese)

[3]陳春, 劉瀟威, 鄭順安, 等. 多環麝香污染脅迫對蚯蚓特異性蛋白基因表達的影響[J]. 環境科學, 2013, 34(5): 1857-1863

Chen C, Liu X W, Zhen S A, et al. Polycyclic musks exposure affect gene expression of specific protein in earthworm Eisenia fetida [J]. Environmental Science, 2013, 34(5): 1857-1863 (in Chinese)

[4]Sommer C. The role of musk and musk compounds in the fragrance industry [J]. The Handbook of Environmental Chemistry, 2004, 3: 1-16

[5]李卓娜, 周群芳, 劉稷燕, 等. 多環麝香(PCMs)的環境行為及毒性效應[J]. 化學進展, 2012, 1(4): 606-615

Li Z N, Zhou Q F, Liu J Y, et al. Environmental behavior and toxicological effects of polycyclic musks [J]. Progress in Chemistry, 2012, 1(4): 606-615 (in Chinese)

[6]Api A M, Smith R L, Pipino S, et al. Evaluation of the oral subchronic toxicity of AHTN (7-Acetyl-1,1,3,4,4,6-hexamethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene) in the rat [J]. Food and Chemical Toxicology, 2004, 42(5): 791-801

[7]Van D B B, Schreurs R, Van D L S, et al. Endocrine effects of polycyclic musks: Do we smell a rat? [J]. International Journal of Andrology, 2008, 31(2): 188-193

[8]郭亞文, 張曉嵐, 錢光人, 等. 城市污泥中合成麝香的分布特征[J]. 環境科學, 2009, 30(5): 1493-1498

Guo Y W, Zhang X L, Qian G R, et al. Distribution character of synthetic musks in urban sewage sludges [J]. Environmental Science, 2009, 30(5): 1493-1498 (in Chinese)

[9]陳多宏, 胡學玲, 盛彥清, 等. 典型污水處理廠中多環麝香的污染特征[J]. 生態環境學報, 2009, 18(1): 101-105

Chen D H, Hu X L, Sheng Y Q, et al. The pollution character of polycyclic musks in a typical wastewater treatment plant [J]. Ecology and Environment Sciences, 2009, 18(1): 101-105 (in Chinese)

[10]Saraiva M, Cavalheiro J, Lanceleur L, et al. Synthetic musk in seafood products from south Europe using a quick, easy, cheap, effective, rugged and safe extraction method [J]. Food Chemistry, 2016, 200: 330

[11]Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(22): 6531-6535

[12]Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24): 7213-7218

[13]高揚, 毛亮, 周培, 等. Cd, Pb污染下植物生長對土壤酶活性及微生物群落結構的影響[J]. 北京大學學報: 自然科學版, 2010, 46(3): 339-345

Gao Y, Mao L, Zhou P, et al. Effect of plant growth on soil enzyme activity and microbe community structure under Cd and Pb stress [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 2010, 46(3): 339-345 (in Chinese)

[14]Misra A, Chosdol K, Sarkar C, et al. Alteration of a sequence with homology to human endogenous retrovirus (HERV-K) in primary human glioma: Implications for viral repeat mediated rearrangement [J]. Mutation Research Aundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2001, 484(1-2): 53-59

[15]Garnis C, Rosin M P, Zhang L, et al. Alteration of AKAP220 , an upstream component of the Rb pathway, in oral carcinogenesis [J]. International Journal of Cancer, 2005, 116(5): 813-819

[16]Singh K P, Roy D. Somatic mutations in stilbene estrogen-induced Syrian hamster kidney tumors identified by DNA fingerprinting [J]. Journal of Carcinogenesis, 2004, 3(1): 4

[17]Singh K P, Roy D. Identification of novel breast tumor-specific mutation(s) in the q11.2 region of chromosome 17 by RAPD/AP-PCR fingerprinting [J]. Gene, 2001, 269(1-2): 33-43

[18]Miki Y, Hashiba M, Hisajima S. Establishment of salt stress tolerant rice plants through step up NaCl treatment in vitro [J]. Biologia Plantarum, 2001, 44(3): 391-395

[19]Chao Y E, Feng Y, Yang X E, et al. Effect of long-term stress of high Pb/Zn levels on genomic variation of Sedum alfredii Hance [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2008, 81(5): 445-448

[20]Liu W, Li P J, Qi X M, et al. DNA changes in barley (Hordeum vulgare) seedlings induced by cadmium pollution using RAPD analysis [J]. Chemosphere, 2005, 61(2): 158-167

[21]Liu W, Yang Y S, Li P J, et al. Risk assessment of cadmium-contaminated soil on plant DNA damage using RAPD and physiological indices [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 161(2-3): 878-883

[22]Liu W, Sun L, Zhong M, et al. Cadmium-induced DNA damage and mutations in Arabidopsis plantlet shoots identified by DNA fingerprinting [J]. Chemosphere, 2012, 89(9): 1048-1055

[23]Gjorgieva D, Kadifkova P T, Ruskovska T, et al. Influence of heavy metal stress on antioxidant status and DNA damage in Urtica dioica [J]. Biomed Research International, 2013, 2013(1): 276-417

[24]Atienzar F A, Jha A N. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review [J]. Mutation Research Aundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2006, 613(2-3): 76-102

[26]Rong Z, Yin H. A method for genotoxicity detection using random amplified polymorphism DNA with Danio rerio [J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2004, 58(1): 96-103

[27]范飛. 土壤環境中人工合成麝香的生態行為及效應研究[D]. 北京：中國科學院研究生院, 2008: 11

Fan F. Ecotoxical behavior and effects of synthetical musks in burozem [D]. Beijing: Graduate School of Chinese Academy of Sciences, 2008: 11 (in Chinese)

[28]陳蘇, 孫麗娜, 孫鐵珩, 等. 人工合成麝香對小麥種子發芽的生態毒性[J]. 環境科學, 2011, 32(5): 1477-1481

Chen S, Sun L N, Sun T H, et al. Ecotoxicity of synthetical musks on wheat (Triticum aestivum) based on seed germination [J]. Environmental Science, 2011, 32(5): 1477-1481 (in Chinese)

[29]Atienzar F A, Cordi B, Donkin M E, et al. Comparison of ultraviolet-induced genotoxicity detected by random amplified polymorphic DNA with chlorophyll fluorescence and growth in a marine macroalgae, Palnaria palnata [J]. Aquatic Toxicology, 2000, 50(1-2): 1-12

[30]范飛, 周啟星, 王美娥. 基于小麥種子發芽和根伸長的麝香酮污染毒性效應[J]. 應用生態學報, 2008, 19(6): 1396-1400

Fan F, Zhou Q X, Wang M E. Toxic effect of musk ketone based on the determinations of wheat (Triticum aestivum) seed germination and root elongation [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(6): 1396-1400 (in Chinese)

[31]張保仁, 崔英, 孟明占. 鎘硒互作對蘿卜種子發芽和幼苗生長的影響[J]. 濰坊學院學報, 2011, 11(6): 68-72

Zhang B R, Cui Y, Meng M Z. Effect of cadmium and selenium on germination and seedling growth of radish seed [J]. Journal of Weifang University, 2011, 11(6): 68-72 (in Chinese)

[32]Liu X, Zhang S, Shan X, et al. Toxicity of arsenate and arsenite on germination, seedling growth and amylolytic activity of wheat [J]. Chemosphere, 2005, 61(2): 293-301

[33]Song Y F, Zhou Q X, Xu H X, et al. Eco-toxicology of heavy metals on the inhibition of seed germination and root elongation of wheat in soils [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2002, 13(4): 459-462

[34]張義賢, 付亞萍, 肖志華, 等. 銅脅迫對不同基因型谷子幼苗基因組DNA多態性的影響[J]. 環境科學, 2013, 34(10): 4090-4095

Zhang Y X, Fu Y P, Xiao Z H, et al. Effect of Cu2+stress on DNA polymorpphism of genome in Foxtail millet of different genotypes [J]. Environmental Science, 2013, 34(10): 4090-4095 (in Chinese)

[35]齊雪梅, 李培軍, 劉宛. Cu脅迫對大麥幼苗生長及DNA 損傷效應的研究[J]. 農業環境科學學報, 2008, 27(5): 1925-1928

Qi X M, Li P J, Liu W. Plantlets growth and DNA damage of barley (Hordeum valgare L) under copper stress [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(5): 1925-1928 (in Chinese)

[36]Mengoni A, Gonnelli C, Galardi F, et al. Genetic diversity and heavy metal tolerance in population of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): A random amplified polymorphic DNA analysis [J]. Molecular Ecology, 2000, 9(9): 1319-1324

[37]解莉婧, 劉宛, 李培軍, 等. 隔脅迫對蠶豆幼苗基因組DNA多態性的影響[J]. 生態學雜志, 2007, 26(1): 35-39

Xie L J, Liu W, Li P J, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in Vicia faba seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2007, 26(1): 35-39 (in Chinese)

[38]詹振楠, 劉宛, 孫梨宗, 等. 鎘脅迫對擬南芥幼苗基因組DNA 多態性的影響[J]. 生態學雜志, 2011, 30(6): 1234-1239

Zhan Z N, Liu W, Sun L Z, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in Arabidopsis thaliana seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2011, 30(6): 1234-1239 (in Chinese)

[39]劉宛, 鄭樂, 李培軍, 等. 鎘脅迫對大麥幼苗基因組DNA 多態性影響[J]. 農業環境科學學報, 2006, 25(1): 19-24

Liu W, Zheng L, Li P J, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in barley seedlings [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(1): 19-24(in Chinese)

[40]孫梨宗, 劉宛, 馬珊珊, 等. 鎘誘導擬南芥幼苗DNA損傷[J]. 生態學雜志, 2012, 31(9): 2337-2343

Sun L Z, Liu W, Ma S S, et al. Cadmium-induced DNA damage of Arabidopsis seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2012, 31(9): 2337-2343 (in Chinese)

[41]李慧, 叢郁, 王宏偉, 等. 鎘對草莓幼苗根尖氧化系統和基因組DNA損傷的影響[J]. 園藝學報, 2010, 37(5): 721-730

Li H, Cong Y, Wang H W, et al. Effects of cadmium stress on oxygen enzyme system and genome DNA polymorphism in the root tips of strawberry plants [J]. Acta Horticulturae Sinica, 2010, 37(5): 721-730 (in Chinese)

[42]Jones C, Kortenkamp L. RAPD library fingerprinting of bacterial and human DNA: Applications in mutation detection [J]. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, 2000, 20(2): 49-63

[43]馬俊旭, 朱大海. 植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究進展[J]. 遺傳, 2003, 25(2): 225-231

Ma J X, Zhu D H. Functional roles of plant superocide dismutase [J]. Hereditas(Beijing), 2003, 25(2): 225-231 (in Chinese)

[44]Berlett B S, Stadtman E R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(33): 20313-20316

[45]尹冬雪, 蘇玉紅, 喬敏. 多環芳烴芘對擬南芥的生物毒性效應[J]. 安徽農業科學, 2011, 39(23): 818-822

Yin D X, Su Y H, Qiao M. Bio-toxicity effect of polycyclic aromatic hydrocarbons pyrene on Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(23): 818-822 (in Chinese)