定性與定量評估4種重金屬及2種農藥混合物對費氏弧菌的毒性相互作用

莫凌云，梁麗營，覃禮堂,* ，秦萌，高歡歡

1. 桂林理工大學環境科學與工程學院，桂林 541004 2. 桂林理工大學，廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004 3. 桂林理工大學，巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，桂林 541004

在現實環境中，人們和生物體總是同時暴露于多種污染物中[1-4]。且這些污染物往往呈現多組分水平，并產生協同、加和、拮抗等毒性相互作用[5-8]。大量混合物毒性研究表明，相互作用濃度比依賴性及效應水平依賴性是常見現象[9-10]，這就需要研究混合物在不同濃度配比下的相互作用，并利用合理的、易實現的方法來對混合物毒性相互作用進行表征。

毒性相互作用評價方法包括：等效線圖、效應相加法、毒性指數法、組合指數[11]、濃度加和(CA)、獨立作用(IA)[12]、及模型偏差比(MDR)等。其中，等效線圖、效應相加法和毒性指數法是最早提出的評估方法。而現在對于混合物毒性評估及預測，使用頻率最高的2個參考模型為CA和IA模型，其中CA模型適用于具有相似作用模式的混合物體系，而IA模型則適用于具有相異作用模式的混合物體系[13-17]。等效線圖是通過圖形進行定性評估，效應相加法、毒性指數法和組合指數法是通過數值比較進行定性評估；CA和IA可進行混合物毒性的定性評估，而模型偏差比(MDR)可進行混合物毒性的定量評估。MDR是CA或IA預測的效應濃度與擬實驗濃度的比值，是比較直觀的評估體系[18-19]。通常認為，MDR = 1、>1和<1分別表示加和、協同和拮抗作用。然而，由于實驗誤差等因素可能使該判斷標準導致錯誤的結論。例如，MDR = 1.1(或0.9)并不能保證混合物產生協同作用(拮抗作用)。因此，在此基礎上，采用實驗觀測值的置信區間(OCI)[20]對毒性實驗數據不確定性進行表征更為合理。

隨著工農業的發展，重金屬和農藥在人為或自然因素下的釋放，造成了重金屬和農藥在水環境中普遍共存。由于環境污染物混合的復雜性，即使相同化學物質組成的混合物，其混合比例不同或相同濃度配比的不同濃度水平下，也會產生不同的毒性相互作用[21-22]。為了研究農藥和重金屬在不同混合比例下的毒性相互作用以及定性和定量表征不同混合比例下的混合物毒性相互作用大小，本研究以費氏弧菌為指示生物，測定2種農藥(敵敵畏(DIC)、敵百蟲(TRC))和4種重金屬(Ni(NO3)2·6H2O[Ni]、ZnSO4·7H2O[Zn]、CdCl2·2.5H2O[Cd]和K2Cr2O7[Cr])構成以等效應濃度比混合的混合物毒性，剖析它們的毒性相互作用。混合物體系包括：農藥-農藥(DIC-TRC)二元混合、重金屬-重金屬(Ni-Zn-Cd-Cr)四元混合和農藥-重金屬(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)六元混合，應用CA和IA對混合物毒性進行定性評估，結合MDR數值及其95%觀測值置信區間進行定量評估其相互作用大小。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　主要試劑與儀器

Ni(NO3)2·6H2O[Ni](CAS號13478-00-7，純度≥98.0%)購于廣東光華科技股份有限公司；ZnSO4·7H2O[Zn](CAS號7446-20-0，純度≥99.5%)購于西隴化工股份有限公司；CdCl2·2.5H2O[Cd](CAS號7790-78-5，純度98.0%)購于damas-beta；K2Cr2O7[Cr](CAS號7778-50-9，純度99%)購于damas-beta；農藥敵敵畏(DIC)(CAS號62-73-7，純度99.5%)、敵百蟲(TRC)(CAS號52-68-6，純度99%)購于DrEhrenstorfer GmbH公司(德國)。

Synergy 2多功能微孔板檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)，YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器(上海醫用核子儀器廠)，SW-CF-IFD型潔凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)，Milli-Q超純水系統(密理博中國有限公司)，Haier藥品保存箱(北京利順航貿易有限公司)，BT25S型五位電子天平(賽多利斯公司)，WZR-D961型微量型振蕩器(蘇州市東吳醫用電子儀器廠)，微板選用96 孔平底不透明聚苯乙烯板(Corning9018)，震蕩培養箱(金壇市億通電子有限公司)。

1.2　菌種與培養

費氏弧菌(Vibrio fischeri)凍干粉(購自北京濱松光子技術股份有限公司)，液體培養基、固態培養基配方及細菌培養方法見文獻[22]。

1.3　毒性測試及混合物射線設計

本研究采用微板毒性分析方法[23]，將加好樣的微孔板放入Synergy 2多功能微孔板檢測儀中，在發光菌與毒物接觸時間為15 min時測定其發光強度。為了減少實驗誤差，提高測量精度，在不同時間、相同條件下，至少進行3次重復實驗。發光抑制率的計算公式如下：

(1)

式中I0為空白對照RLU的平均值，I為各濃度3次平行樣的RLU平均值。

對于具有一定組成的每個混合物體系，應用等濃度比法設計4條混合物射線(EE-NOEC、EE5、EE10和EE50)，同一條射線中某組分的濃度分數或濃度比(pi)即該組分濃度所占混合物總濃度的分數保持不變。2種農藥和4種重金屬可構成3個混合物體系為農藥二元混合體系(DIC-TRC)、重金屬四元混合體系(Ni-Zn-Cd-Cr)、農藥與重金屬六元混合體系(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)。每組混合物體系設計4條混合物射線[24]，共設計12條混合物射線，其濃度比例詳見表1。

表1　混合物射線濃度比(pi)及擬合參數Table 1　Concentration ratios (pi) and fitting parameters of mixture rays

注：EE-NOEC表示單一物質的NOEC等效應混合；混合物射線EE5、EE10和EE50分別表示單一物質的EC5、EC10和EC50等效應混合。

Note: EE-NOEC is the mixture designed at the NOEC of single compounds; mixture rays EE5, EE10, and EE50are the mixtures designed at the EC5, EC10, and EC50of single compounds.

1.4　濃度-效應曲線擬合

由微板毒性分析方法測定的2種農藥和4種重金屬以及它們的混合物濃度-效應數據，應用Weibull函數對其進行非線性擬合，Weibull函數見式(2)。

E=1-exp(-exp(α+βlgc))

(2)

式中α和β分別是位置參數和斜率參數，E為效應即發光抑制率，c是單一化合物或混合物濃度。模型擬合優度采用統計量均方根誤差(RMSE)和決定系數(R2)表征，RMSE越小，R2越大，說明擬合效果更顯著。

通過Weibull反函數，可求得單一化合物或混合物在任意效應下的濃度。在混合物體系設計中，單一物質的EC5、EC10和EC50利用Weibull反函數計算。通過Dunnett檢驗原理[25]，利用t檢驗法比較單一物質處理組平均值與實驗空白對照組平均值之間的顯著性差異，決定處理濃度組是否為NOEC。在本文的毒性測試中，每個毒物由3次重復的12個濃度梯度毒物處理組和1個空白控制組的抑制率數據，構成Dunnett檢驗數據，計算組間方差、總體方差、組內方差、組內平均值標準差、毒物處理組與空白之間比較之統計量tj，比較各處理組統計量tj與臨界值t(通過查t臨界值表獲得)推算NOEC。NOEC及所有相關計算在化學混合物毒性評估與預測(APTox)方法體系中完成[26]。

1.5　混合物毒性評估

1.5.1定性評估混合物毒性相互作用

通過CA、IA及其混合物濃度-效應曲線95%實驗觀測值的置信區間(OCI)[20]定性評價混合物毒性相互作用，當CA和IA位于混合物濃度-效應95% OCI上限和下限表示加和效應，低于95% OCI下限表示協同作用，高于95% OCI上限表示協同作用。

CA可以用下面的公式(3)表示[27-28]：

(3)

式中ECx,mix為混合物產生效應x時混合物的濃度(mol·L-1)，ECx,i表示混合物中第i個化合物單獨存在時所產生效應x時的濃度(mol·L-1)，pi為混合物中第i個組分的濃度占混合物總濃度的比例。

IA可用公式(4)表示[27-28]：

(4)

式中fi為第i個組分濃度-效應函數，cmix是混合物的總濃度 (mol·L-1)。

混合物濃度-效應曲線的95% OCI定義如下[20]：

(5)

式中α為顯著性水平(α=0.05)，t為自由度(n-m)在置信水平為α下的臨界值，自由度(n-m)等于22(36-12-2)，可由t分布表查得(t22,0.025= 207 387)，C為由非線性最小二乘回歸得到的參數估計值的協方差矩陣，s為觀測值標準偏差。

1.5.2定量評價混合物毒性相互作用

為了能夠更加準確地評估混合物毒性相互作用，通過MDR及其對應的95% OCI置信區間進行判斷。MDR定義為某指定效應下參考模型CA或IA預測的效應濃度(ECx, PRE)與實驗濃度(ECx, OBS)的比值[29]。

(6)

式中ECx,PRE通過CA或IA計算，混合物ECx,OBS通過Weibull反函數計算。利用95% OCI ECx,OBS的置信區間上限ECx,上限和下限ECx,下限替代等式(6)中的分子，根據相對模型偏差比(rMDR)置信區間的定義[30]，MDR的置信區間上限(MDR上限)和下限(MDR下限)定義如下：

(7)

(8)

在指定效應下，MDR大于MDR上限時為協同作用，MDR小于MDR下限時為拮抗作用，MDR位于MDR上限和MDR下限之間為拮抗作用。

2　結果與討論(Results and discussion)

2.1　單一重金屬及農藥毒性

微板毒性分析法測得4個重金屬及2個農藥對費氏弧菌的濃度-效應曲線(CRC)如圖1所示，采用Weibull函數進行擬合得到相關參數及NOEC(通過Dunnett檢驗獲得)、EC5、EC10與EC50見表2。由圖1和表2可知擬合結果良好，TRC的毒性(pEC50=2.08)比Cd(pEC50=4.23)的毒性小了2個數量級。以pEC50作為標準，其毒性大小順序為：Cd > Zn > Ni > Cr> DIC > TRC。

2.2　農藥-農藥混合毒性

DIC-TRC二元混合物體系各射線的擬合參數(α和β)及統計值(R2和RMSE)與pEC50值等列于表1。從表1可以看出，DIC-TRC混合物體系的毒性隨著DIC的濃度降低而有所降低。

各混合物射線對費氏弧菌的濃度-效應(數據點)、觀測置信區間及CA與IA模型曲線結果列于圖2，混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA預測結果明顯偏離實驗數據點，呈現明顯的協同作用。混合物射線EE50在低濃度區域呈加和作用，高濃度為弱協同作用，明顯小于混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的協同作用。因此，這說明同一混合物體系中不同濃度比的混合物射線毒性相互作用不一樣。

圖1　6個化合物對費氏弧菌的劑量-效應關系Fig. 1　Dose-response relationships for 6 compounds to Vibrio fischeri

圖2　農藥二元混合物對費氏弧菌毒性的CRC及CA和IA預測結果注： “·”為實驗數據點，“--”表示95%實驗觀測值置信區間。Fig. 2　The CRCs of acute toxicity of binary mixture of pesticides to Vibrio fischeri and the CA and IA predictionsNote: “·” is the experimental data, “--” is the observation-based confidence interval.

化合物CompoundαβR2RMSE效應濃度/(mol·L-1)Effectconcentration/(mol·L-1)NOECEC5EC10EC50EC50置信區間ConfidenceintervalNi10.373.520.99540.02687.39E-051.62E-042.60E-048.91E-047.74E-04～1.04E-03Zn6.311.730.91520.10001.75E-054.32E-061.13E-051.39E-044.00E-05～3.86E-04Cd10.002.450.99630.02455.44E-065.08E-061.00E-055.87E-054.93E-05～7.14E-05Cr5.171.870.99660.01284.23E-054.44E-051.08E-041.10E-039.82E-04～1.26E-03DIC12.705.900.99830.01811.47E-032.21E-032.92E-036.10E-035.47E-03～7.12E-03TRC2.851.550.99690.01332.23E-041.76E-045.12E-048.41E-037.22E-03～9.58E-03

基于95% OCI的MDR方法定量表征DIC-TRC混合物體系在10%～90%效應范圍的相互作用列于圖3。從MDR及其95%OCI隨效應x%的變化可知混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10的MDR值均在置信區間的上方，呈現出明顯的協同作用。最大協同作用發生在低效應和低濃度區域，隨著效應及混合物濃度增加，協同作用大小逐漸減弱。混合物射線EE-NOEC在10%效應下的MDRCA和MDRIA分別為58.43和70.24(MDR下限=0.68，MDR上限=1.37)，在50%效應下協同作用大小達到30.6(MDRCA和MDRIA數值)。混合物射線EE5、EE10的協同作用大小接近于混合物射線EE-NOEC。混合物射線EE50的10%效應的MDR值位于95%OCI下限和上限，例如在5%效應下，混合物MDRCA=1.02和MDRIA=1.08在95% OCI下限(MDR下限=0.47)和上限(MDR上限=1.57)之間，表明混合物在該效應下為加和效應。混合物射線EE50的效應大于15%時CA和IA計算的MDR值均在置信區間上限的上方，即混合物發生協同作用，且協同作用最大發生在40%效應下，MDRCA和MDRIA分別為1.96和2.46，均大于95%OCI上限(MDR上限=1.10)。

混合物組分之間的協同作用與組分濃度、暴露時間和指示生物等多種因素有關。對于DIC-TRC二元混合物體系對費氏弧菌的急性毒性，相同混合物射線(相同濃度比例)在不同的濃度范圍的協同作用大小發生明顯變化，不同濃度比例的混合物射線的協同作用也不同。因此，混合物濃度及組分的濃度比例是相互作用的主要影響因素之一。

2.3　重金屬-重金屬混合毒性

重金屬Ni-Zn-Cd-Cr四元混合物體系的擬合參數(α和β)、統計值(R2和RMSE)、pEC50值及混合物濃度比例等列于表1，從表1可以看出每條混合物射線所含重金屬含量不同，其混合物的毒性沒有明顯差異，pEC50值為3.22～3.46。圖4給出Ni-Zn-Cd-Cr重金屬混合物體系的4條混合物射線對費氏弧菌的濃度-效應數據、95%OCI及CA和IA模型預測結果。從圖4可以看出3條混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA預測結果位于95%OCI下限和上限之間，表明混合物為加和效應。混合物射線EC50的CA和IA預測結果在95%置信區間上限的上方即為拮抗作用。圖5給出四元混合物體系的MDR圖，3條混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的MDR值均在95%OCI下限和上限之間，為加和效應。混合物射線EE50的MDR值位于95%OCI下限的下方，為拮抗作用。混合物表現出拮抗作用則意味著該組混合物中，起決定作用的組分在對費氏弧菌致毒過程中出現了不同的毒性效應或者類似競爭作用位點的可結合性的降低，從而減弱了對方的毒性。

圖3　基于CA和IA模型的農藥二元混合物MDR值Fig. 3　The MDR value of binary pesticide mixture based on CA and IA models

圖4　重金屬四元混合物對費氏弧菌毒性的CRC及CA和IA預測結果Fig. 4　The CRCs of acute toxicities of mixtures of four heavy metals to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

圖5　重金屬四元聯合效應下CA和IA模型的MDR值Fig. 5　The MDR values of four-component joint effect of heavy metals based on CA and IA models

2.4　農藥-重金屬混合毒性

農藥-重金屬六元混合物體系的擬合參數(α和β)、統計值(R2和RMSE)與pEC50值等列于表2，并將模擬曲線與實驗測定的CRC數據散點圖繪于圖6所示，由CA和IA模型計算的MDR值如圖7所示。從圖6中可以看出，通過CA與IA定性評估農藥-重金屬六元混合物體系的毒性，4條混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10和EE50實測CRC在整個濃度區間均高于CA和IA預測結果，呈協同作用。從圖7中可以看出，4條混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10、EE50的MDR值均在置信區間上限的上方，呈現出明顯的協同作用。在50%效應下，混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10和EE50的MDRCA和MDRIA值分別為4.05和4.91(MDR下限=0.87，MDR上限=1.13)、6.12和7.98(MDR下限=1.42，MDR上限=1.83)、3.70和4.60 (MDR下限=0.88，MDR上限=1.14)、2.62和2.59(MDR下限=0.92，MDR上限=1.09)。因此，該六元混合物體系的協同作用大小隨著組分濃度變化而變化。出現協同作用的原因，是由于2種農藥與4種重金屬共同存在時，細菌的細胞膜通透性增強，污染物更容易入進去到細胞內與酶進行反應，導致發光減弱，對細菌的毒性也就增強[31-32]。

從以上結果可知，四條DIC-TRC二元混合物射線不同濃度水平對費氏弧菌的急性毒性中，除了EC50比混合物射線為弱協同作用外均有非常顯著的協同效應。四元重金屬混合物體系中，除了混合物射線EE50具有弱的拮抗作用外均為加和作用。在六元農藥-重金屬混合物體系中，4條混合物射線均表現出不同的協同作用，且協同作用大小在10%～90%效應范圍呈現減弱的趨勢，該趨勢與DIC-TRC二元混合物體系的結果相似。因此，二元混合物(MDRCA和MDRIA大于60)的協同作用明顯大于六元混合物(MDRCA和MDRIA小于8)。污染物之間的協同作用與組分濃度配比和混合物濃度密切相關。

圖6　重金屬與農藥六元混合物對費氏弧菌急性毒性的CRC及CA和IA預測結果Fig. 6　The CRCs of acute toxicities for six components mixtures of heavy metals and pesticides to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

圖7　基于CA與IA模型的重金屬與農藥六元混合物MDR值Fig. 7　MDR values for six components mixtures of heavy metals and pesticides based on CA and IA

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