北京東靈山樹線處土壤細菌的PICRUSt基因預測分析

厲桂香,馬克明

1 中國科學院生態環境研究中心,城市與區域生態國家重點實驗室,北京　100085 2 中國科學院大學,北京　100049

樹線是指從郁閉度較高的森林冠層向郁閉度較低的森林冠層過渡,并且高度≥3m的樹木所處的位置[1]。樹線作為生態交錯帶的主要類型,因其特有的敏感性和動態性,可以作為氣候變化監測的早期信號[2]。樹線的響應特征是表征全球變化的指示器,隨著全球氣候變暖,樹線上移是備受關注的熱點問題。樹線上移將對生物多樣性、地下微生物、乃至整個生態系統都造成嚴重影響[3- 4]。對樹線上下土壤生物群落進行研究,將會為預測高海拔生態系統及其功能對氣候變化的響應提供重要參考價值。

土壤細菌是土壤微生物中數量最大、種類最多、功能多樣的類群。作為土壤中重要的分解者,土壤細菌在整個土壤物質循環和能量流動中起著至關重要的作用。土壤細菌與地上植物有著緊密的聯系,地上植物可以通過凋落物的輸入以及根系分泌物來改變土壤的物理和化學性質[5- 7],從而間接影響土壤細菌群落。

土壤微生物的分類學多樣性與功能多樣性有密切聯系,但并沒有顯著相關性[3, 8]。隨著高通量測序技術的發展,土壤細菌多樣性受到極大關注,但我們對土壤細菌在樹線處的功能基因變化還不清楚[3, 9]。土壤微生物對環境的作用主要是通過微生物群落代謝功能差異來實現。因此,了解微生物功能特性的分布規律對于更好的理解生態系統功能、生物地球化學循環以及微生物對環境改變的響應具有重要作用[8]。

近幾年發展起來的高通量測序技術,如Illumina平臺的MiSeq測序,以及羅氏454等,逐步提高了對土壤中微生物多樣性的檢測。通過對標記基因如16S rRNA基因進行測序,可以獲得環境樣品的微生物區系組成。但是,想要獲得微生物的功能信息就需要對宏基因組進行研究,其數據量龐大,成本非常高。隨著計算軟件的創新,利用預測軟件對標記基因數據進行預測,分析樣本中微生物群落代謝和宏基因組,成為一種高效、經濟的方法[10- 12]。PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)是一個開發于2012年的預測宏基因組功能基因的生物信息學軟件包[11],可以通過16S rRNA基因序列,預測對應細菌和古菌的代謝功能譜,相關論文發表數量逐年增長[13-14]。如2016年的一項研究[15]通過PICRUSt預測了吸煙人群和未吸煙人群的口腔菌群,發現有83個基因功能代謝通路存在顯著差異；Wu等利用PICRUSt研究了三七根腐病對應的微生物功能的改變[16]。

本研究通過對北京東靈山遼東櫟林及草甸的土壤細菌群落進行研究,提出以下科學問題：(1)樹線如何影響土壤細菌群落結構及功能基因的分布？(2)哪些功能基因對樹線這種環境突變響應顯著？

1　材料與方法

1.1　土壤樣品采集

采樣地點位于北京東靈山地區。東靈山坐落于北京森林生態系統定位研究站(30°57′29 N, 115°25′33 E)。該區屬暖溫帶半濕潤季風氣候,寒冷期長,積溫低,凍土期長,生長季短,年均溫5—10℃,年降雨500—650mm,70%的降水出現在6到8月[17]。地帶性土壤類型為肥沃褐色土和棕色森林土。從低海拔到高海拔的植被類型有次生灌木(Vitexnegundo,Spiaeaspp)、櫟樹混交林(Quercusliaotungensis)、樺樹林(Betuladahurica, platyphylla)、亞高山草甸(Forbmeadows)。

土壤樣品采于遼東櫟林向亞高山草甸的過渡帶,在遼東櫟林內取17個10m×10m的樣方,海拔范圍1676—1770m。在樹線之上的亞高山草甸共取21個10m×10m樣方,海拔范圍1790—2280m。去掉土壤表層凋落物后,用環形土鉆取10cm厚的土壤,在每個10m×10m的樣方中共取六鉆土混合為一個樣品。新鮮土樣充分混合,過2mm的篩,冷凍干燥后放入-80℃冰箱中用于細菌DNA的提取。

1.2　樣品處理

每個樣品稱取冷凍干燥后的土壤0.25g。使用MOBIO Power Soil試劑盒(MO Bio Laboratories, USA)來提取土壤總DNA,依據試劑盒內的操作流程進行。將提取好的DNA保存在-40℃冰箱中備用。

采用PCR擴增技術對細菌16S rRNA基因高變區的V4-V5區進行擴增。合成帶有barcode序列(用于區分各個樣品)及接頭序列的特異引物515F/907R(前引物,515F, 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′；后引物,907R, 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。PCR擴增體系為(25μL)：4μL 5×FastPfu Buffer,2μL 2.5mmol/L dNTPs,0.4μL前后引物(5mmol/L),0.4μL FastPfu聚合酶(TransGen, Beijing)以及10ng DNA模板。反應條件如下：95℃預變性2min,(95℃/30s,55℃/30s,72℃/45s)×30個循環,最后72℃延伸10min。每個樣品3個重復,將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物,Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測,之后按照每個樣品的測序量要求,進行相應比例的混合。之后進行MiSeq文庫構建并測序。用Illumina MiSeq platform的(PE 2×300)進行高通量測序。

1.3　數據分析

對MiSeq測序得到的數據進行拼接,同時對序列的質量和拼接效果進行質控過濾,并根據序列末端的box序列校正序列方向。拼接后的數據用QIIME v.1.8.0軟件[18]進一步質控：序列長度小于200bp,50nt的移動窗口中Q值小于30,含有模糊堿基,引物堿基中有大于一個的錯配,以及不能夠被任何的barcode識別的序列,所有包含這些條件的序列將會被去掉[19]。用UCHIME[20]軟件基于“RDP Gold”數據庫檢測和去除嵌合體序列。對已去除嵌合體序列的文件依照Galaxy在線平臺的流程先進行OTU聚類分析：首先是用QIIME軟件中的pick_closed_reference_otus.py命令基于97%的相似度,依據13_5 Greengenes數據庫,得到out_table.biom,并對其進行序列標準化,用于后續的群落結構和功能預測。

將QIIME軟件得到的biom文件上傳到Galaxy網站進行PICRUSt功能基因預測分析。將得到的功能基因中的信息參考KEGG Orthology的1級和2級功能基因類別劃分歸類,可得到預測基因組的功能組成。研究表明,PICRUSt對于土壤中細菌的預測準確率較高[11]。利用PICRUSt軟件對已測得的16S rRNA基因數據進行預測,分析樣本功能基因組成是一種高效的方法。

每個土壤樣品的細菌群落豐富度是通過計算每個樣品的OTU(operational taxonomic unit)獲得。細菌物種數以及預測功能基因和海拔之間的相關關系用多元或線性回歸方法進行分析。擬合適合度采用調整的R2和P進行判定。基于Bray-Curtis相似性矩陣的PCoA分析用于分析土壤細菌群落組成和預測基因功能多樣性的變異,并用多元的相似性分析方法ADONIS(Adonis test, Vegan package in R)檢驗變異的顯著程度[21]。

2　研究結果

2.1　土壤細菌多樣性

圖1　土壤細菌物種數沿海拔的變化(虛線代表樹線處海拔)Fig.1　Elevational pattern of soil bacterial richness

本研究采取的38個樣品共計得到829756條序列,根據97%的相似度共劃分成11625個OTU(物種數)。每個樣品的序列數在10450到30503條之間。經過分類共計得到39個細菌門分類單元,其中優勢分類門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi),占到總序列數的90%以上。優勢分類門放線菌門和酸桿菌門在森林和草甸中表現出差異,放線菌門在森林和草甸中的相對多度分別為17.6%、20.7%,而酸桿菌門分別為17.5%、13.9%。

土壤細菌物種數(OTU)沿海拔沒有表現出明顯的趨勢,在樹線處也沒有明顯的下降(圖1)。

2.2　土壤細菌群落結構變化

圖2　細菌群落結構在森林和草甸之間差異的PCoA排序分析Fig.2　PCoA analysis of community structure between forest and meadow

基于Bray-Curtis距離的細菌群落組成在PCoA分析的第一排序軸上明顯分成兩個區域(AdonisF1,36=5.116,R2=0.12,P=0.001；圖2),主要是森林和草甸之間的差異,解釋率為22.8%。第二排序軸顯示,在森林和草甸內部的細菌群落組成也有差異,但小于第一排序軸,解釋率僅為10%。

2.3　PICRUSt基因預測

通過對KEGG數據庫進行比對,共獲得6類生物代謝通路功能分析：代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環境信息處理(Environmentalin-formation processing)、細胞過程(Cellular processes)、有機系統(Organismal systems)、人類疾病(Human diseases)。其中代謝、遺傳信息處理、細胞過程、人類疾病等的功能基因多度沿海拔呈現顯著的下降趨勢,并且在樹線處明顯的下降(圖3)。

圖3　預測功能基因多度沿海拔的變化趨勢(一級功能層)Fig.3　Elevational pattern of predicted functional profiles (hierarchy level 1)

二級功能層共包含39種子功能,根據Bray-Curtis距離矩陣計算出預測功能基因β多樣性,PCoA分析結果發現在第一排序軸是明顯分成兩個區域(AdonisF1,36=5.3815,R2=0.13,P=0.001；圖4),森林和草甸內的細菌功能組成差異顯著。

圖4　土壤細菌預測功能基因在森林和草甸之間差異的PCoA排序分析(二級功能層)Fig.4　PCoA analysis of predicted functional profiles between forest and meadow (hierarchy level 2)

在39個二級預測功能中有10個子功能的相對多度在森林和草甸中具有明顯差異(圖5)。其中,其他次生產物代謝的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)、轉錄(Transcription)、多糖生物合成和代謝(Glycan biosynthesis and metabolism)、酶家族(Enzyme families)、信號分子及交互作用(Signaling molecules and interaction)、環境適應(Environmental adapation)、細胞生長和死亡(Growth and death)等的功能基因在森林中明顯高于草甸中。而維他命及輔因子代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、膜運輸(Membrane transport)、內分泌系統(Endocrine system)等的功能基因在草甸中偏高。

圖5　預測功能基因在森林和草甸之間的差異(二級功能層)Fig.5　The variation of predicted functional profiles between forest and meadow (hierarchy level 2)

3　討論

土壤微生物地理學研究發現,OTU的多樣性經常隨地理或環境梯度呈現不明顯的變化[22-23],但是群落結構[22]和功能基因[8,24]常表現出明顯的差異和變化趨勢。本研究顯示,土壤細菌物種多樣性在樹線處沒有顯著變化,也沒有沿海拔梯度呈現出明顯的分布趨勢,但群落結構和預測功能基因都在樹線處發生了顯著變化,與之吻合。

PCoA分析顯示,森林和草甸之間以及森林和草甸內部的土壤細菌群落組成均有差異,說明可能存在海拔的影響。從森林到草甸,植物群落結構一直隨海拔梯度在變化,土壤細菌群落結構的變化可能與植物群落變化有關。雖然很多研究認為土壤微生物物種多樣性與植物群落往往并沒有顯著相關[23, 25-26],但是土壤微生物可以通過改變土壤養分來影響植物生長和初級生產力[27]。進而,植物群落通過凋落物輸入與根系分泌物等過程改變土壤的理化性質。這一過程不僅會影響土壤微生物在群落中的有無,還會影響到其在群落中的多度,從而影響土壤微生物群落結構[28- 29]。

PICRUSt基因預測結果顯示,代謝、遺傳信息處理、細胞過程、人類疾病等4類功能基因的多度沿海拔呈線性下降趨勢,并且功能基因的組成也在樹線上下明顯不同。以往的研究利用基因芯片的技術也發現了林線交錯群落功能基因多樣性的變化,例如Ding等[3]在神農架的研究發現樹線上下的灌木和針葉林群落中土壤微生物功能基因結構組成具有明顯差異；Shen等[8]在長白山的研究也發現林線交錯群落土壤微生物功能基因多樣性發生變化。這些結果均表明,海拔梯度可能通過影響植物群落的變化進而影響土壤微生物的功能基因。

已有研究表明,植物群落對土壤微生物群落結構的影響,可能會進一步導致土壤微生物群落功能組成的差異[30]。樹線上下的氣候環境條件顯著差異,植被群落明顯不同,導致微生物生活的微生境及養分需求有差異,從而對土壤微生物具有篩選作用[9],進而影響微生物的功能組成。一方面,森林和草甸因為凋落物輸入的差異而對土壤養分及其他生態過程產生不同的影響,從而導致土壤微生物的功能差異。森林土壤環境中存在著豐富的木質纖維資源,土壤微生物中存在著大量與木質纖維素代謝相關的菌系。而草甸群落植物多樣性低,凋落物類型簡單,根系不發達,根系分泌物種類及數量相對較少,因此可供微生物利用的資源較少。降雨淋溶、太陽光輻射等非生物因素在凋落物的分解過程中扮演重要的角色,而土壤微生物分解相對弱[31]。另一方面,從森林到草甸,隨海拔上升溫度下降,低溫可能導致土壤微生物活動減弱。Ding等的研究也發現溫度是影響林線兩側土壤微生物結構和功能的重要因素,本研究中一些和代謝相關的功能基因分類如其他次生產物代謝的生物合成、多糖生物合成和代謝、酶家族等在草甸中明顯下降,總體微生物功能基因多度在樹線處有明顯的下降。但是也有一些二級分類的功能基因在草甸中明顯高于森林,如膜運輸、內分泌系統等,這些功能基因可能有助于微生物在相對嚴酷的環境中有效利用土壤養分[16]。

4　結論

在本項研究的海拔梯度上,土壤細菌群落結構與功能基因組成在樹線上下顯著差異,且功能基因多度隨海拔呈下降趨勢,敏感地反映了海拔梯度及樹線的環境變化,揭示了土壤和植被對土壤細菌群落的影響規律。未來土壤微生物生態學研究,應該更加關注群落組成與功能而非物種多樣性,加強微生物群落功能和結構的分布規律及機制研究。

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