XBP1/CHOP/Puma信號轉導通路對高糖心肌細胞凋亡的作用研究

王 麗 李 強 楊莉莉 李俊毅 邵海峰

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院心血管一科,齊齊哈爾 161000)

近年來，以糖尿病為主的代謝綜合征成為影響人類健康的主要慢性疾病之一，據統計，預計到2030年全球糖尿病患者將達到4.5億左右，其中糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)的人數也相當可觀[1，2]。糖尿病心肌病是指糖尿病患者在無其他因素引起心臟異常的情況下出現的心臟能量代謝或結構異常的一類疾病，其病理特征主要為心肌肥大、局灶性壞死和纖維化、小動脈內膜增厚等，發病率和死亡率在糖尿病心臟并發癥中位于第二位[3]。心肌細胞的增殖、凋亡廣泛參與DCM等心腦血管疾病的病理生理過程[4-6]。內質網應激是新近發現的細胞凋亡信號轉導通路，X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)是內質網應激的關鍵信號因子、參與蛋白質折疊和內質網合成的結構蛋白[7]。本實驗通過RNA干擾XBP1的表達，探討XBP1對高糖環境下心肌細胞增殖、凋亡的影響和作用機制，以期為DCM的治療和診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 H9C2心肌細胞由齊齊哈爾醫學院實驗室保存，DMEM培養基、胎牛血清(Fatal bovine serum，FBS)均購自美國Gibco公司，XBP1 siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成并鑒定，轉染試劑脂質體2000(Lipofectamine 2000)購自美國Invitrogen公司，CCK-8檢測試劑盒、Annexin V/PI試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國公司Santa Cruz等。

1.2方法

1.2.1細胞培養與處理 細胞培養：心肌細胞培養于DMEM培養基中，加入10%的FCS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞融合度為70%～90%時使用0.25%的胰酶消化傳代培養，取生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

細胞處理：取對數期的細胞，胰酶消化成單細胞懸液，接種于六孔板上，每孔加入1×105個細胞，待細胞融合度達到80%～90%時，離心，棄去培養基，PBS緩沖液清洗，每孔加入10 μl脂質體Lipofectamine 2000，細胞中分別加入siRNA-XBP1(siRNA-XBP1組)、siRNA-NC(對照組)，以β-actin為內參，蛋白免疫印跡(Western blot)檢測XBP1蛋白的相對表達量。

高糖干預實驗分為4組：低糖對照組(使用5.5 mmol/L 葡萄糖作用于細胞，LG組)、高糖刺激組(使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細胞，HG組)、高糖加siRNA-NC(使用XBP1 siRNA-NC預處理細胞24 h，使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細胞，HG+NC組)、高糖加XBP1-siRNA組(使用XBP1 siRNA預處理細胞24 h，使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細胞，HG+siRNA)，各組細胞在培養箱中培養48 h。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖情況 收集對數期細胞，每孔加入100 μl培養基調整細胞濃度為1×105個/孔，37℃、5%CO2孵育48 h，至細胞單層鋪滿孔底，每組5個復孔。每孔加入10 μl CCK-8溶液，細胞培養箱中繼續孵育4 h，在450 nm測定吸光值(OD值)，試驗重復3次，計算細胞存活率。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 胰酶處理細胞，轉移至離心管內，離心，PBS緩沖液重懸細胞密度為(5～10)×105個/ml，取1 ml細胞置于新的離心管中，加入5 μl膜聯蛋白-V(Annexin V)-FITC混合液和10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕振動混勻，避光，置于流式細胞儀中進行檢測。

1.2.4Western blot 檢測細胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達 當細胞融合度達到80%～90%時，PBS緩沖液清洗細胞，離心，取上清，加入預冷的5 μl磷酸酶抑制劑、5 μl PMSF、1 μl蛋白酶抑制劑，靜置30 min，15 000 r/min離心10 min，上清即為蛋白提取物，BCA法進行蛋白定量。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，按照纖維墊-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-纖維墊的順序安裝轉印夾層，進行轉膜。轉膜結束后，將硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下振蕩2 h。加入一抗反應液，4℃孵育過夜，TBST洗膜液清洗3次，每次10 min；加入二抗，室溫振蕩2 h，TBST洗膜液清洗3次，每次10 min，反應結束后加入ECL化學發光顯色，室溫反應1 min，暗室中曝光1～2 min，分別浸入顯影液和定影液中30 s，試驗重復3次，使用Quantity One 軟件進行統計分析，蛋白的相對含量為目的蛋白OD值/β-actin OD值。

2 結果

2.1Western blot檢測XBP1蛋白的表達量 Western blot檢測轉染后細胞中XBP1 蛋白的表達量，結果如圖1、表1所示，對照組和siRNA-XBP1組細胞中XBP1蛋白的表達量分別為(0.859±0.091)、(0.283±0.059)。與對照組相比，siRNA-XBP1組細胞中XBP1蛋白的表達量明顯下降(t=9.199,P<0.05)，說明XBP1 siRNA能夠有效降低XBP1的表達。

2.2CCK-8檢測細胞增殖情況 各組細胞的增殖情況如表2所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞的存活率分別為(100.25±10.036)%、(60.413±7.526)%、 (62.891±7.796)%、 (80.107±6.058)%；與LG組相比， HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞的存活率均顯著降低(t1=5.500,P1=0.005，t2=5.092,P2=0.007，t3=2.976,P3=0.041)；與HG組相比，HG+NC組細胞的存活率無顯著差異(t=0.396,P=0.712)，但HG+siRNA組細胞的存活率明顯升高(t=3.531,P=0.024)。

2.3流式細胞術檢測細胞的凋亡情況 各組細胞的凋亡情況如圖2、表3所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞的凋亡率分別為(9.963±1.534)%、(48.563±5.398)%、(46.279±6.243)%、(20.489±3.421)%；與LG組相比，HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞的凋亡率均顯著升高(t1=11.914，P1=0.000，t2=9.784，P2=0.001，t3=4.863,P3=0.008)；與HG組相比，HG+NC組細胞的凋亡率無顯著差異(t=0.479,P=0.657)，但HG+siRNA組細胞的凋亡率明顯降低(t=7.609,P=0.002)。

2.4Western blot 檢測細胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達 結果如表4、圖3所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞中XBP1蛋白的表達量分別為(0.246±0.051)、(0.859±0.047)、(0.843±0.086)、(0.423±0.072)；C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表達量分別為(0.195±0.056)、(0.762±0.083)、(0.724±0.060)、(0.480±0.061)；p53上調凋亡調控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，Puma)的表達量分別為(0.153±0.025)、(0.642±0.051)、(0.651±0.073)、(0.450±0.058)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表達量分別為(0.134±0.042)、(0.601±0.013)、(0.620±0.042)、(0.306±0.060)。與LG組相比，HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細胞中XBP1(t1=15.309,P1=0.000，t2=10.342,P2=0.001，t3=3.475,P3=0.026)、CHOP(t1=9.809,P1=0.001，t2=11.164,P2=0.000，t3=5.961,P3=0.004)、Puma(t1=14.912,P1=0.000，t2=11.179,P2=0.000，t3=8.145,P3=0.001)、Caspase-3(t1=18.398,P1=0.000，t2=14.172,P2=0.000，t3=4.068,P3=0.015) 的表達量均顯著增加；與HG組相比，HG+NC組細胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達量沒有明顯變化(t1=0.282,P1=0.791，t2=0.643,P2=0.555，t3=0.175,P3=0.870，t4=0.749,P4=0.796)，但HG+siRNA組細胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達量顯著降低(t1=8.783,P1=0.001，t2=4.742,P2=0.009，t3=4.306,P3=0.013，t4=8.323,P4=0.001)。

圖1 siRNA干擾細胞中XBP1蛋白的表達量Fig.1 Expression of XBP1 protein in siRNA interfe-ring cells

GroupsExpressionofXBP1proteinControlgroup0.859±0.091siRNA-XBP1group0.283±0.0591)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

表2XBP1siRNA對高糖處理的心肌細胞存活率的影響

GroupsSurvivalrate(%)LGgroup100.25±10.036HGgroup60.413±7.5261)HG+NCgroup62.891±7.7961)HG+siRNAgroup80.107±6.0581)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

GroupsRateofapoptosis(%)LGgroup9.963±1.534HGgroup48.563±5.3981)HG+NCgroup46.279±6.2431)HG+siRNAgroup20.489±3.4211)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

GroupsXBP1CHOPPumaCaspase-3LGgroup0.246±0.0510.195±0.0560.153±0.0250.134±0.042HGgroup0.859±0.0471)0.762±0.0831)0.642±0.0511)0.601±0.0131)HG+NCgroup0.843±0.0861)0.724±0.0601)0.651±0.0731)0.620±0.0421)HG+siRNAgroup0.423±0.0721)2)0.480±0.0611)2)0.450±0.0581)2)0.306±0.0601)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

圖3 心肌細胞XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達Fig.3 Expression of XBP1,CHOP,Puma and Caspase-3 proteins in cardiomyocytes

3 討論

糖尿病心肌病已被認為是一個獨立的、特異的心肌疾病。在糖尿病各種并發癥中，細胞的增殖、凋亡異常將導致心功能嚴重受損[8]。高血糖癥是誘發糖尿病并發心血管疾病的重要因素之一。有研究表明，67.1%的糖尿病并發心血管患者均伴有血脂異常[9]。因此有必要研究高糖狀態下心肌細胞凋亡的分子機制。內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)和未折疊蛋白質反應(Unfolded protein response，UPR)是細胞內重要的凋亡信號通路[10]。XBP1是ERS的重要調節因子，當受到應激時即被活化，激活多條信號通路發揮作用[11]。文獻報道，當細胞受到應激時，激活UPR信號通路，從而使XBP1被活化轉移至細胞核中，調控UPR下游靶基因及多種信號因子的表達，調節疾病的發生、發展[12]。研究表明下調XBP1的表達量會導致相關下游靶基因的表達量降低，參與新血管生成、能量代謝、細胞的增殖和凋亡等過程[13]。在DCM的病程中，高血糖、氧化應激等因素均可誘發ERS和UPR，從而導致心肌細胞的增殖受到抑制，凋亡率增加。然而在這一過程中，XBP1對心肌細胞增殖、凋亡的影響及作用機制的相關報道較少。所以本實驗通過RNA干擾XBP1在高糖環境下的心肌細胞的表達量，觀察其表達量對心肌細胞增殖和凋亡的影響。結果顯示siRNA-XBP1可降低心肌細胞中XBP1的表達量；高糖環境可抑制細胞的增殖，誘導其凋亡，但XBP1的表達量降低可緩解高糖促進細胞凋亡的作用。

CHOP也稱為GADD153，是ERS調控的凋亡信號通路中的關鍵因子之一，當發生ERS反應時，受轉錄因子調控，表達水平增加，從而調節凋亡相關基因表達介導細胞凋亡[10]。研究發現，當細胞α-細辛醚處理細胞時可激活ERS，調節ERS下游靶基因CHOP的表達從而誘導細胞的凋亡[14]。有文獻報道在心肌細胞中，CHOP的表達量升高激活心肌細胞凋亡途徑抑制其增殖[15]。Puma是促凋亡基因，對細胞凋亡、增殖起重要作用。有研究表明，Puma為CHOP下游靶基因，發揮促進細胞凋亡的作用[16]。在線粒體內膜上，Puma與Bcl-2或者Bax結合，增強線粒體膜的通透性，釋放細胞因子，誘導Caspase級聯反應，促進細胞凋亡。研究證明，丙烯醛可提高Puma的表達量，裂解Bid，從而誘導Caspase-3的活化，促進細胞凋亡[17]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，是細胞凋亡過程中的剪切酶。

Caspase-3可通過與底物結合，降解下游底物，從而促進細胞凋亡。研究報道當機體受到異常刺激時，通過升高Caspase-3的表達量，從而促進細胞的凋亡，抑制其增殖[18-20]。本實驗檢測了siRNA干預XBP1和高糖環境下心肌細胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的含量，發現高糖環境可使XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達量升高，但XBP1表達量降低可抑制高糖促進XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達量升高，且CHOP、Puma的表達量隨著XBP1的降低而降低，表明高糖環境下，激活ERS，但XBP1表達量降低可降低高糖激活ERS的作用，其作用機制是通過調控XBP1/CHOP/Puma信號通路從而促進心肌細胞的凋亡。

總之，RNA干擾XBP1的表達可抑制高糖環境下心肌細胞的凋亡，促進其增殖，防止糖尿病心肌病的惡化，其作用機制是通過調節XBP1/CHOP/Puma信號通路發揮作用。

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當然，女貪官腐敗還有諸多其他動機，例如僥幸心理、補償心理、攀比心理等。筆者認為，僥幸心理只是上述投機心理的別樣稱呼，基于不平衡心理而生的補償心理只是一種自我報償心理，仍不出“報償”的范疇，而攀比心理看似 “趨寡”實為“追風”，只是對“從眾”的表面偏離，仍屬從眾心理的范疇，故于此不再論述。

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