羅哌卡因對結腸癌細胞增殖和裸鼠人結腸癌皮下瘤生長的影響

高 聰 林大勇 韓 勇 劉 兵

(四川省人民醫院急診科,成都 610072)

外科腫瘤切除術是治療結腸癌的主要方法[1]。研究表明，手術期是癌癥發展最易受影響的階段[2]。手術期間腫瘤血管的破裂和手術操作不當都可能導致癌細胞進入體循環，造成癌癥的轉移和復發[2,3]。此外，手術期間全麻藥物的使用可導致機體免疫功能抑制，進一步增加癌癥轉移和復發的風險[4]。近年研究表明，在腫瘤切除手術期間使用局麻藥物能降低乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種癌癥的復發率[5-7]。有數據分析指出，在結腸癌手術期間使用局麻藥物的患者預后明顯優于使用全麻藥物的患者[8]。羅哌卡因是臨床常用的局麻藥物之一[8]。研究表明，羅哌卡因可通過調控Na+通道的開放明顯抑制結腸癌細胞的侵襲和轉移能力[9]，但其對結腸癌細胞增殖能力的影響及作用機制還較少見報道。因此，本文將從體內體外兩方面探討羅哌卡因對結腸癌細胞增殖和腫瘤生長的影響，以進一步闡明局麻藥物羅哌卡因影響結腸癌患者預后的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM/F12培養基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司。CO2培養箱購自德國Binder公司，流式細胞儀購自美國BD公司，垂直電泳儀和半干轉膜儀購自美國Hoefer公司。CCK8試劑盒、BCA試劑盒和Tunel試劑盒購自中國碧云天生物科技公司。Ki67、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和細胞周期蛋白A (Cyclin A) 抗體購自美國CST公司，caspase-3、caspase-9、p53和磷酸甘油醛脫氫酶 (Glyceraldhyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 抗體購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人結腸癌細胞系SW480購自中國科學院上海細胞所細胞庫。將SW480細胞用含10%胎牛血清、100 U青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基培養于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中，隔天換液。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 當細胞匯合率達到80%時，將細胞傳代接種至96孔板中，并用不同濃度的羅哌卡因 (0、1、2、5、10、20、50、100、200、400、800 μg/ml) 處理SW480細胞。48 h后按照CCK8試劑盒說明書加入CCK8試劑，孵育2 h后，用酶標儀于450 nm檢測細胞吸光度。

1.2.3腫瘤成球實驗 將結腸癌細胞傳代接種于低黏附六孔板中，每孔5 000個細胞。將細胞隨機分為Ropivacaine 0、20、50和100 μg/ml組，每組6個復孔。用含相應濃度羅哌卡因的培養液處理細胞48 h后，用含有4 μg/ml 肝素的DMEM培養液進行培養，兩周后用結晶紫染色，每孔隨機選取六個視野拍照統計。

1.2.4Western blot 用羅哌卡因處理細胞48 h，每孔加入2 ml預冷的蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每組各取蛋白樣品30 μg 用12% SDS-PAGE分離并轉移蛋白至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入一抗封閉過夜 (Ki67,1∶1 000;PCNA,1∶850;cleaved caspase-3,1∶700;cleaved caspase-9,1∶900;p53,1∶1 000;Cyclin A,1∶800) 。一抗封閉完成后，TBST清洗3次，室溫封閉對應HRP標記二抗1 h，最后加入ECL顯色液于暗室曝光顯影。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 用羅哌卡因處理細胞48 h后，用胰酶消化收集細胞，加入70%乙醇4℃固定過夜。第二天用PBS清洗除去乙醇，加入1 mg/ml的 RNase A室溫孵育30 min。30 min后加入PI，室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 用羅哌卡因處理細胞48 h，用0.25%的胰酶消化收集細胞，PBS清洗三次后，用70%乙醇4℃固定1 h。固定結束后加入PI和PE-Annexin V室溫孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7Xenograft模型建立 雄性BALB/C裸鼠購自北京實驗動物中心。適應性喂養3 d后，將裸鼠隨機分為SW480組、Ropiv (5 mg/kg BW) 組、Ropiv (10 mg/kg BW) 組和Ropiv (20 mg/kg)組 ，每組12只。除SW480組外，其余組裸鼠于腹股溝皮下注射對數期的SW480細胞，細胞密度為1×107個/ml。以有腫瘤長出視為造模成功。Ropiv (5 mg/kg BW) 組、Ropiv (10 mg/kg BW) 組和Ropiv (20 mg/kg) 組分別連續腹腔注射給予5、10和20 mg/kg的羅哌卡因5 d，每天一次，SW480組給予等量溶媒。分別于造模后的1、3、7、10、14、18、21、24、28和32 d測量記錄腫瘤長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積 (腫瘤體積=a×b2/2)，并統計裸鼠存活情況，計算存活率 (存活率=存活數/裸鼠總數×100%) 。

1.2.8Tunel檢測細胞凋亡 將裸鼠連續喂養32 d后，處死動物并取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定過夜后，制作冰凍切片并保存于液氮中備用。根據Tunel試劑盒說明書檢測腫瘤組織的細胞凋亡情況。用4%多聚甲醛室溫固定腫瘤切片30 min后，加入0.5%的TritonX-100室溫通透15 min。用2%過氧化氫室溫孵育5 min，滴加含TdT酶的Tunel反應液37℃孵育1 h，1 h后終止反應，最后用0.05%的DAB染色液進行復染，于顯微鏡下隨機選取6個視野記錄統計。

2 結果

2.1羅哌卡因對結腸癌細胞活性的影響 為了探究羅哌卡因對SW480活性的影響，確定后續實驗用藥濃度，我們用CCK8法檢測了細胞活性。實驗結果表明，當羅哌卡因濃度低于100 μg/ml時，對結腸癌細胞的活性無明顯影響，濃度達到200 μg/ml時，細胞活性降至80%以下 (圖1) 。因此，我們選擇了對細胞無顯著毒性的低中高 (20、50、100 μg/ml) 三個劑量進行后續試驗。

2.2羅哌卡因對結腸癌細胞增殖的影響 為了探究羅哌卡因對結腸癌細胞增殖的作用，我們檢測了SW480細胞的成球情況及增殖標記蛋白的表達情況。腫瘤成球實驗結果表明，與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，Ropivacaine 20、50和100 μg/ml組成球細胞數明顯減少(圖2) ，并具有量效關系；同時，羅哌卡因 (20、50、100 μg/ml) 還能明顯抑制細胞增殖標記蛋白Ki67和PCNA的表達(圖3) ，表明羅帕卡因能抑制結腸癌細胞增殖。

2.3羅哌卡因對結腸癌細胞凋亡的影響 流式細胞術實驗結果表明，當羅哌卡因濃度為50和100 μg/ml時，能顯著促進結腸癌細胞凋亡 (圖4) 。與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，Ropivacaine 50 μg/ml組和Ropivacaine 100 μg/ml組結腸癌細胞凋亡標記蛋白Cleaved caspase-3的表達水平明顯升高(圖3)；同時，羅哌卡因(20、50、100 μg/ml)還可明顯促進Cleaved caspase-9的表達(圖3)。

2.4羅哌卡因對結腸癌細胞周期的影響 用不同濃度羅哌卡因處理細胞48 h后，與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，20 μg/ml組的G0/G1期細胞數減少，G2/M期細胞數增多，但差異沒有統計學意義；Ropivacaine 50 μg/ml組 (37.6%) 和100 μg/ml組 (32.2%) 的G0/G1期結腸癌細胞數較0 μg/ml組 (46.3%) 比較均明顯減少，G2/M期細胞數均顯著增多，并且隨濃度的增高作用逐漸增強(圖5)；此Cyclin A的表達(圖3) ；濃度為50和100 μg/ml時還能明顯促進p53的表達(圖5) ，以上結果均提示羅哌卡因可誘導SW480細胞發生G2期阻滯，從而抑制結腸癌細胞的生長。

2.5羅哌卡因對腫瘤生長的影響 為了探究羅哌卡因對腫瘤生長的影響，我們復制結腸癌Xenograft模型，并統計了腫瘤的生長情況及結腸癌小鼠的存活情況。實驗結果表明，連續喂養裸鼠28 d后，Ropiv 10組和Ropiv 20 mg/kg BW組裸鼠的腫瘤組織體積較SW480組比較明顯減小(圖6) ；同時，連續飼養32 d，羅哌卡因(5、10、20 mg/kg)可明顯抑制腫瘤細胞的生長(圖2) ；此外，羅哌卡因還能提高裸鼠生存率，并體現出量效關系(圖6)。

2.6羅哌卡因對腫瘤組織細胞凋亡的影響 進一步研究結果表明，與SW480組比較，Ropiv 10和20 mg/kg BW組腫瘤組織的凋亡小體明顯增多(圖7)，表明羅哌卡因能誘導結腸癌細胞凋亡，進而抑制腫瘤的生長。

圖1 羅哌卡因對結腸癌細胞活性的影響Fig.1 Effect of ropivacine on cell viability of colon cancerNote: Cells were seeded in 96-well plates and treated with ropivacaine at different concentrations；A.The chemical structure of ropivacaine;B.CCK8 assay was performed for cell viability of SW480 cell.All experiment were repeated at least three times.n=6.

圖2 羅哌卡因對結腸癌細胞集落形成的影響Fig.2 Effect of ropivacaine on colony formation of colon cancer cellNote: *.P<0.05,#.P<0.01,△.P<0.001 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖3 羅哌卡因對結腸癌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of ropivacaine on apoptosis of colon cancer cellNote: A.Flow cytometry was performed for apoptosis;B.Quantification of Fig.3A.#.P<0.01 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖4 羅哌卡因對結腸癌細胞周期的影響Fig.4 Effect of ropivacaine on cell cycle of colon cancer cellNote: A.Cell cycle was detected by flow cytometry;B.Quantification of Fig.4A.#.P<0.01 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖5 羅哌卡因對細胞增殖標記蛋白、凋亡標記蛋白和細胞周期標記蛋白表達的影響Fig.5 Effect of ropivacaine on proliferation-,apoptosis-and cell cycle-related proteinsNote: GAPDH was used as a loading control.*.P<0.05,#.P<0.01,△.P<0.001 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖6 羅哌卡因對腫瘤生長的影響Fig.6 Effect of ropivacaine on growth of tumorNote: Xenograft model of colon cancer was employed and mice were treated with ropivacaine for 5 days.All experiments were performed after 32 days.A.Growth cave of colon tumor;B.Survival cave of mice with colon cancer.*.P<0.05,#.P<0.01 versus SW480 group.

圖7 羅哌卡因對腫瘤組織細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of ropivacaine on apoptosis in colon tumorNote: A.Apoptosis of colon tumor was measure by Tunnel assay;B.Quantification of Fig.7A.#.P<0.01,△.P<0.001 versus SW480 group.

3 討論

機體自身免疫應答是影響癌癥發生發展的重要因素[10]。研究表明，在腫瘤切除手術過程中，全麻藥物的使用會降低機體免疫力，從而增加癌細胞轉移的風險[3]。如揮發性麻醉藥物和阿片類藥物能通過抑制NK細胞活性從而發揮對免疫系統的負向調控作用[11,12]。近年來局麻藥物的使用較大程度上避免了這一弊端。大量研究表明，局麻藥物可抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡[13-15]。利多卡因可誘導淋巴瘤T細胞凋亡，布比卡因可誘導成神經細胞瘤及結腸癌細胞的凋亡，抑制癌細胞增殖[16-18]。也有研究表明，羅哌卡因可抑制結腸癌細胞侵襲和遷移，大劑量的羅哌卡因可抑制結腸癌細胞增殖[8,18]。本文研究表明，羅哌卡因可抑制結腸癌細胞SW480集落的形成，同時還能抑制細胞增殖標記蛋白Ki67、PCNA的表達，并隨濃度升高，抑制作用逐漸增強。此外，羅哌卡因還能抑制裸鼠結腸癌皮下瘤的生長，提高了裸鼠的存活率。進一步證明羅哌卡因能通過抑制結腸癌細胞增殖和結腸癌皮下瘤生長減緩結腸癌的發展。

細胞凋亡是指由基因調控的細胞自主性的程序性死亡，其在維持內環境穩定中發揮了重要的作用。研究表明，細胞凋亡抑制是癌癥的一個重要特征[19]。在癌癥發展過程中，細胞凋亡的抑制能促進癌細胞的增殖和腫瘤的生長[20]。研究表明，局麻藥物羅哌卡因可通過促進細胞凋亡抑制血清誘導的HT29、CaCO2結腸癌細胞增殖[21]。在無血清培養條件下，羅哌卡因也可促進結腸癌細胞凋亡，抑制癌細胞生長[22]。本文研究結果表明，羅哌卡因可誘導結腸癌細胞SW480凋亡，能明顯促進凋亡標記蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的表達，同時還可顯著促進結腸癌Xneograft模型小鼠腫瘤組織凋亡小體的形成，進一步表明羅哌卡因可促進結腸癌細胞凋亡，從而抑制結腸癌細胞增殖。

研究表明，細胞周期的調控與癌細胞的增殖和凋亡密切相關[23]。細胞周期分為四個階段，包括G1期、S期、G2期和M期。G1期是細胞對增殖正調控或負調控做出應答的階段，DNA復制主要發生在S期，G2期DNA復制終止并開始合成大量的RNA和蛋白質，為M期細胞的分裂做準備[24]。本文研究發現，羅哌卡因可顯著減少處于G0/G1的結腸癌細胞，處于G2/M期的細胞明顯增多，S期細胞數無明顯變化，表明羅哌卡因可能通過誘導結腸癌細胞發生G2期阻滯而抑制癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡。細胞周期是由多種細胞因子共同調控的結果。其中Cyclin A是細胞周期起始階段最重要的蛋白之一，其在整個G1期和S期都大量表達，主要參與DNA的復制，因此在多種癌癥中均呈現高表達狀態[25,26]。p53是一類抑癌基因，能誘導癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，在調控DNA修復和維持染色體完整性的過程中也發揮了重要的作用[27,28]。我們的研究表明，羅哌卡因可促進SW480細胞p53的表達，同時抑制細胞周期蛋白Cyclin A 的表達，提示羅哌卡因誘導結腸癌細胞發生細胞周期阻滯與調控細胞周期相關蛋白p53和Cyclin A的表達有關。

綜上所述，羅哌卡因可抑制結腸癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，并且可能與其誘導SW480細胞發生細胞周期阻滯有關。同時，羅哌卡因還能通過抑制腫瘤生長及促進腫瘤組織細胞凋亡而提高結腸癌裸鼠的生存率。本研究闡明了羅哌卡因對結腸癌的作用，可能為羅哌卡因應用于結腸癌手術麻醉，降低結腸癌的復發率提供了新的理論依據，但其作用機制還有待進一步探討。

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