mok E基因過表達對紅曲霉Monacolin K產量、菌絲及孢子形態的影響

林 琳，王昌祿*，李貞景，陳勉華，武淑芬，任志遠

紅曲霉（Monascus spp.）具有有性生殖和無性生殖2 個生殖期。有性生殖期形成子囊和閉囊殼，無性繁殖過程中形成分生孢子[1]。紅曲是以大米為原料，經過紅曲霉發酵而成的一種紫紅色米曲，被李時珍稱為“造化之巧著”，是藥食兩用之奇才[2-3]。紅曲色素是一種天然染色劑，同時紅曲霉的次級代謝產物還具有降血脂、降血壓、抑制癌細胞增殖等功效[4-12]。近年來，紅曲發酵產物被用于治療登革熱病毒感染[13]。莫納可林K（Monacolin K，MK）又叫洛伐他汀，是功能性紅曲霉次級代謝產物中主要功能成分[14-15]。不同培養基種類能夠影響MK產量[16-19]。祁田甜等[20]通過等離子體誘變技術選育高產MK的紅曲霉突變株。2010年，Chen Yipei等[21]將mok H基因過表達，發現能夠提高MK產量。

紅曲霉mok E基因對應編碼脫氫酶，該脫氫酶與土曲霉中由lov C編碼的烯醇還原酶相似度為84%[22]。研究表明，lov C編碼的烯醇還原酶能催化反應，使土曲霉MK合成前體物質——九酮化合物[23]。本課題組基于前期研究結果，確定了表達量與MK產量呈正相關的基因[17]。選取MK生物合成基因簇中mok E基因進行基因過表達，以提高MK產量，通過掃描電鏡對轉化子菌絲體及孢子形態進行觀察，為進一步研究基因過表達與MK產量及菌體、孢子之間的相關性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

紅曲霉M1由天津科技大學食品生物技術研究室保存。

大麥芽、大米 市售；RNA提取試劑盒 美國Omega公司；GV3301農桿菌、pCAMBIA1301質粒 天津科技大學食品生物技術研究室；T4連接酶、SYBRII Mix日本TaKaRa公司；HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒 康為世紀生物科技有限公司；Bsp119I、BglII內切酶 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基：將大麥芽粉碎，稱取500 g，加入2 L水，55～60 ℃保溫糖化3～4 h，濾去殘渣，煮沸、過濾，加水稀釋至糖度為12°Brix，加入3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L。取100 mL培養液分裝至250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：在液體種子培養基中加入3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。超凈工作臺內將培養基倒入已滅菌的平板中，待培養基凝固后，鋪上已剪好的無菌玻璃紙，將氣泡趕出，備用。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；LRH-250-GII型培養箱 廣東省醫療器械廠；KCL-2000W型恒溫恒濕培養箱 日本東京理化器械株氏會社；XL-3型掃描式電子顯微鏡 日本日立公司；SW-CJ-1FD型號超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 過表達載體連接與轉化

對pCAMBIA1301質粒及mok E基因（含酶切位點及保護堿基）通過Bsp119I及BglII分別進行雙酶切，純化，在T4連接酶作用下16 ℃連接過夜[24]，連接產物經雙酶切驗證，確認連接成功。連接產物通過農桿菌介導紅曲霉進行轉化，轉化步驟參考邵彥春[25]方法：將野生型紅曲霉孢子與經乙酰丁香酮誘導劑處理的農桿菌共培養，在含有潮霉素抗性培養基上涂布，30 ℃黑暗培養3 d，有菌體長出則為轉化子。

1.3.2 mok E基因表達水平的測定

分別稱取轉化子菌體100 mg，提取菌絲體RNA，反轉錄為cDNA，利用逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）法測定mok E基因表達水平，確定mok E基因過表達成功的轉化子。RT-qPCR體系為：11 μL水；12 μL SYBRII Mix；1 μL cDNA；上下游引物各0.5 μL；總體系25 μL；每個樣品做3 個平行實驗。反應程序如下：95 ℃、30 s循環1 次；95 ℃、5 s，57 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共循環40 次。所用引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 List of primers used in RT-qPCR

1.3.3 發酵產物中MK的檢測

1.3.3.1 MK固態發酵及樣品處理

將在麥芽汁培養基上30 ℃活化7 d的紅曲霉M1接種至種子液培養基，30 ℃培養48 h，在無菌操作臺中用4～6 層無菌紗布過濾孢子懸液，用無菌水將孢子濃度調至106個/mL。在固態發酵培養基中心位置加入20 μL孢子懸液，待菌液干燥后，30 ℃倒置培養6 d后，于25 ℃培養12 d。分別將培養至18 d的野生型紅曲霉M1及經篩選的轉化子玻璃紙取下，剝落玻璃紙，得菌體，50 ℃烘干，研磨成粉末，稱取0.50 g。用10 mL 75%乙醇溶液分3 次進行萃取，每次超聲30 min，3 500 r/min離心15 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，待測。每個樣品做3 個平行實驗。

1.3.3.2 MK標準品的制備及檢測

配制質量濃度分別為5.00、10.00、50.00、100.00、200.00、400.00 μg/mL的MK標準溶液。用高效液相色譜法測定MK標準品，并繪制標準曲線。

1.3.3.3 高效液相色譜檢測條件

檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長237 nm；色譜柱：Agilent X DB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進樣體積：20 μL；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液體積比60∶40，等度洗脫。

1.3.3.4 掃描電鏡觀察

分別將野生型紅曲霉M1及轉化子培養至18 d，取菌體，放置于2.5%戊二醛溶液中固定6 h，用pH 7.2，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，經50%、70%、90%和100%乙醇溶液梯度脫水，每次15 min，冷凍干燥，待用。用Eiko IB-3型離子濺射儀噴金，XL-3型掃描式電子顯微鏡（20 kV）掃描[26-27]觀察形態。

2 結果與分析

2.1 過表達載體質粒連接與轉化結果

mok E基因長度為1 294 bp，連接于Bsp119I及BglII兩個位點之間。位于CaMV 35s啟動子下游，mok E基因含有終止子。質粒圖譜[24]如圖1所示。mok E基因片段全長為1 294 bp，由圖2可知，在1 000～2 000 bp之間有片段，且與目的片段大小相符，表明mok E基因與pCAMBIA1301質粒連接成功，可用于后續的轉化實驗。

圖1 過表達質粒圖譜Fig. 1 Schematic representation of the overexpression vector

圖2 連接產物雙酶切驗證凝膠電泳結果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of pCAMBIA-mok E with double enzyme digestion

pCAMBIA1301質粒含有潮霉素抗性基因，按照1.3.1節農桿菌介導絲狀真菌的轉化方法，對連接好的過表達質粒進行轉化，共得到240 個轉化子，按照選取菌落直徑大、長勢良好的9 個轉化子（部分轉化子如圖3所示）進行遺傳穩定性檢測，結果表明5 代遺傳穩定。

圖3 野生型及轉化子菌落形態Fig. 3 Morphological features of the wild-type strain and transformants

2.2 mok E基因表達量測定結果

由圖4可知，WS M1為野生型紅曲霉M1菌株中mok E基因表達水平，T1轉化子為轉入空質粒的轉化子，作為陰性對照，其mok E基因水平未增加。T2、T8、T9菌株中mok E基因水平均增加，表明在T2、T8、T9菌株中mok E基因過表達成功，其mok E基因表達量分別為野生型mok E基因表達量的1.57、4.63、2.39 倍。

圖4 野生型紅曲霉M1與轉化子mok E基因表達水平Fig. 4 Expression levels of mok E gene in the wild-type strain M1 and transformants

2.3 MK產量測定結果

2.3.1 MK標準曲線

根據MK標準溶液濃度及峰面積計算得到MK標準曲線的線性回歸方程為y=63.48x＋13.50，相關系數R2=0.999。

2.3.2 野生型紅曲霉M1及轉化子內酯型MK產量

圖5 野生型紅曲霉M1與4 株轉化子的內酯型MK產量Fig. 5 Monacolin K lactone production by wild-type strain M1 and 4 transformants

由圖5可知，野生型紅曲霉M1 MK產量為1 447.8 μg/g，T2、T8、T9轉化子內酯型MK產量增長明顯，而轉入空質粒的T1轉化子內酯型MK產量增長不明顯，表明mok E基因過表達能夠提高紅曲霉MK產量。這與Chen Yipei等[21]的結論一致，對與MK產量呈正相關的基因進行過表達能夠提高MK產量。其中，T8轉化子內酯型MK產量最高為4 177.6 μg/g，比野生型紅曲霉內酯型MK產量提高了188.5%。T2、T9轉化子內酯型MK產量分別為2 159.7、3 365.7 μg/g，MK產量較野生型分別提高了49.2%、132.5%。

2.4 基因過表達對菌絲及孢子形態的影響

由圖6a可知，紅曲霉菌絲有大量分枝，菌絲體密實，多呈網結聯合，在分枝的頂端具有單個或成串的球形或橢圓形囊實體。這與Ji等[28]的描述一致。野生型紅曲霉存在大量的分生孢子，即在菌絲頂端或側面小梗頂端的倒梨形球體。由圖6b～d可知，T2、T8、T9轉化子中分生孢子數量少，球狀閉囊殼數量多。以分生孢子進行的繁殖為無性繁殖，而產生閉囊殼的過程為有性繁殖[29]。這表明mok E基因過表達，對紅曲霉菌絲及孢子形態有一定的影響。推測mok E基因過表達使菌絲體長度變短，菌絲之間網結聯合減少，從而促進MK產生。而菌絲體較短，網聯結構稀疏能夠促進絲狀真菌次級代謝產物的產生，這與王莉衡[30]的研究結果一致。有研究表明，利于菌絲生長的環境也利于無性繁殖，即分生孢子的產生，但一般不利于有性繁殖[31]，這與本實驗結果一致。

圖6 野生型M1及mok E基因過表達轉化子掃描電鏡（×800）Fig. 6 Scanning electron micrographs of wild-type strain M1 and mok E overexpressing transformants (× 800)

3 結 論

選取紅曲霉MK生物基因簇中mok E基因進行過表達，共得到240 個轉化子；挑取菌落直徑大、生長良好的9 個轉化子，測定其mok E基因表達量，發現3 株mok E基因表達量增加的轉化子T2、T8、T9。MK產量測定結果表明，T2、T8、T9轉化子內酯型MK產量比野生型紅曲霉的內酯型MK產量分別提高了49.2%、188.5%及132.5%。說明mok E基因過表達能夠提高MK產量。

對野生型紅曲霉M1及轉化子菌絲、孢子進行掃描電鏡觀察。結果顯示mok E基因過表達，對紅曲霉的菌體生長、孢子形態及生殖方式均有影響。推測mok E基因過表達是通過影響紅曲霉菌絲體及孢子的生長，最終影響MK的產生。該結果對通過生物技術手段研究MK產生與菌體、孢子生長的相關性提供了理論支持。

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