QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜測定牛奶中有機氯農藥及多氯聯苯的分析

付文雯，羅 彤，朱 影，周陶鴻，文 紅，王會霞*

有機氯農藥和多氯聯苯屬于持久性環境有機污染物，雖已禁用多年，但由于其難降解，具有毒性、親脂性、半揮發性和生物富集性等特點，在土壤、沉積物、水和部分食品中仍能檢測到，并且通過生物富集和食物鏈對人體健康產生威脅，環境暴露和膳食暴露是人類面臨持久性有機污染物的兩大途徑[1-5]。因此，建立簡單、快速、有效的有機氯農藥和多氯聯苯的檢測方法，對于保證食品安全和保護人類健康具有重大的現實意義。

目前，有機氯農藥和多氯聯苯殘留量常用的檢測方法有氣相色譜電子捕獲檢測法、氣相色譜-質譜法[6-8]等。由于有機氯農藥和多氯聯苯在樣品中含量低，且食品基質復雜，在分析前通常需要用有機溶劑輔助微波、超聲等進行提取、凝膠滲透色譜、固相萃取、基質分散固相萃取[9-12]等方法進行凈化后再濃縮上樣分析。這樣不僅操作繁瑣而且耗時，靈活性不強，對前處理的輔助設備要求也高。QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）由美國化學家Lehotay等于2003年提出的一種用于蔬菜、水果等農產品中多農藥殘留量檢測的快速前處理技術[13-15]，其優勢在于操作簡單、分析速度快、且回收率、準確度等較高。QuEChERS是基于基質分散萃取機理，其基本流程是采用乙腈提取，萃取鹽析分層，最后在有機層中加入吸附劑除去基質干擾物達到凈化目的，目前，有超過200 種農藥殘留可采用此方法進行測定[16]。根據不同樣品基質以及不同目標物的理化特性差異，可以通過調整提取溶劑、吸附劑等改進QuEChERS前處理技術，讓其應用于更加廣泛的領域。根據資料顯示，該方法經過改良后也應用于動植物樣品中農藥殘留[17-19]，其中還包括中藥材樣品[20]，茶葉中尼古丁[21]和動物源性食品中獸藥殘留[22-23]的檢測，但在牛奶樣品中的應用報道較少。因此，本研究擬沿用QuEChERS方法的思路建立牛奶樣品的快速前處理方法，通過氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）分析樣品，以基質標準曲線定量，建立QuEChERS-GC-MS/MS法檢測牛奶中有機氯農藥和多氯聯苯殘留的方法，為實現牛奶中有機氯農藥和多氯聯苯殘留的快速監測提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購；正己烷（色譜純）；有機氯標準品 農業部環境保護科研監測所；多氯聯苯標準品 美國Accustandard公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）、弗羅里硅土填料、MgSO4、C18填料 北京迪馬科技有限公司；濃硫酸（優級純）。

1.2 儀器與設備

TSQ 8000 GC-MS/MS聯用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AIIegra X-22R多功能臺式冷凍離心機 美國貝克曼公司；XH-C渦旋混合器 江蘇金怡儀器科技公司；MSA125P-1CE-DU分析天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備液：將8 種有機氯農藥（六六六（α-hexachlorocyclohexane，α-HCH）、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、滴滴伊（pp’-dichlor odiphenyldichloroethylene，pp’-DDE）、滴滴滴（pp’-dichlorodiphenyldichlorothane，pp’-DDD）、滴滴涕（op’-dichlorodiphenyltrichloroethane，op′-DDT）、pp’-DDT）標準品和7 種多氯聯苯（2,4,6-三氯聯苯（2,4,6-trichlorobiphenyl，PCB28）、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）標準品，用正己烷稀釋至1 μg/mL，4 ℃保存備用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5.0 g樣品至50 mL離心管中，加入30%硫酸-甲醇2 mL，2 g無水硫酸鎂，陶瓷均質子，渦旋5 min，放入－18 ℃冷凍5 min，加入10 mL正己烷溶液，渦旋5 min，以4 000 r/min離心3 min，取上層清液2 mL加入弗羅里硅土100 mg、C18150 mg、MgSO4200 mg，渦旋1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3.3 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱：HP-1701MS毛細管柱（30.0 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：150 ℃保持1 min，以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持9 min；以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持8 min；進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣方式：不分流進樣。

質譜條件：電子電離源；電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度270 ℃，溶劑延遲7.5 min，燈絲電流100 μA，多反應監測模式，其具體參數見表 1，有機氯和多氯聯苯的總離子流圖見圖1。

表1 有機氯農藥和多氯聯苯保留時間、定性及定量離子對Table 1 Retention times, qualitative ions and quantitative ions of organochlorine pesticide and polychlorinated biphenyls

圖1 有機氯農藥和多氯聯苯總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram of organochlorine pesticide and polychlorinated biphenylsin standards

2 結果與分析

2.1 提取試劑的優化

乳及乳制品基質復雜，含有蛋白質、脂類、酚類、碳水化合物等雜質，在提取前對其進行一定處理，可以提高提取的效率。本實驗以純牛奶為研究對象，分別比較了在添加B（4% KOH-甲醇）、C（10%硫酸-甲醇）、D（亞鐵氰化鉀-乙酸鋅（1∶1））、E（3%乙酸）作用后對提取效率的影響（A為陰性對照），結果見圖2。

圖2 不同處理方式對提取效率的影響Fig. 2 Effect of different pretreatments on extraction efficiency

脂肪在堿性條件下水解生成甘油和高級脂肪酸的鈉鹽，采用KOH-甲醇進行前處理，可以有效降低牛奶里的脂肪含量[24-25]，從而提高提取的效率，除γ-HCH、δ-HCH外，其余指標回收率均較高，可能是HCH在堿性環境中穩定性弱于酸性環境的原因。采用硫酸-甲醇進行甲酯化，高濃度的硫酸可以破壞牛奶中蛋白質、脂肪等有機物[26]，使樣品在一定程度上“碳化”，而且酸催化酯化在含水樣品中也可以進行[27]，因此硫酸-甲醇能很好地消除蛋白質和脂肪的干擾，有利于下一步的提取，并且各指標在酸性環境穩定性均較好，采用10%硫酸-甲醇進行甲酯化后再進行提取各指標的回收率均較高。

2.2 硫酸-甲醇體積分數的優化

稱取5 份相同濃度的加標樣品5.0 g，分別加入A（5%硫酸-甲醇）、B（10%硫酸-甲醇）、C（20%硫酸-甲醇）、D（30%硫酸-甲醇）、E（40%硫酸-甲醇）2 mL，加入2 g無水硫酸鎂，陶瓷均質子，渦旋5 min，放入－18 ℃冷凍5 min，加入10 mL正己烷溶液，渦旋5 min，以4 000 r/min離心3 min，取上層清液2 mL加入弗羅里硅土200 mg、C18100 mg、MgSO4300 mg，具體結果見圖3。

圖3 硫酸-甲醇體積分數對提取效率的影響Fig. 3 Effect of sulfuric acid concentration mixed with methanol on extraction efficiency

反應的溫度和酸質量分數對酸催化甲酯化的影響都比較大[27]，本研究的宗旨是快速有效，因此采用提高硫酸的質量分數和加無水硫酸鎂來替代加熱，牛奶中含有大量的水分，高體積分數的硫酸-甲醇加入時會放熱，無水硫酸鎂加入時也會放熱，利用這個溫度來催化反應的進行。但值得注意的是，需要在離心管中加入陶瓷均質子，無水硫酸鎂容易產生結塊，而陶瓷均質子可以打碎結塊，充分分散基質，提高提取效率。實驗結果表明，在30%硫酸-甲醇水平下各指標回收率均相對較好。

2.3 凈化填料的優化

常用的凈化劑有PSA、C18、弗羅里硅土、GCB等固相萃取填料，它們分別對有機酸、非極性、極性物質、色素等有不同程度的吸附，但前期預實驗發現PSA對δ-HCH有強烈的吸附，根據本實驗樣品及目標物質的特性，最終選用C18、弗羅里硅土為凈化劑。據相關文獻報道，無水硫酸鎂的脫水效果比無水硫酸鈉強[28]，本實驗中選用無水硫酸鎂為脫水劑。在5 μg/kg加標水平下，以2 mL提取液為研究對象，對凈化條件進行優化。

2.3.1 C18用量的選擇

實驗固定弗羅里硅土用量為200 mg，MgSO4用量為300 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（150 mg）、D（200 mg）、E（250 mg）、F（300 mg）C18。結果表明，大部分指標的回收率隨著C18用量的增加呈現先增加后下降的狀態，并在C18為150 mg時達到最大值。C18主要在去除非極性雜質方面效果良好[29]，而有機氯農藥和多氯聯苯屬于非極性較強的化合物，C18用量過大，吸附完雜質，過多的C18會對目標化合物產生吸附，因此，最終選用C18用量為150 mg，結果見圖4。

圖4 C18用量對提取效率的影響Fig. 4 Effect of C18 dosage on extraction efficiency

2.3.2 MgSO4用量的選擇

實驗固定弗羅里硅土用量為200 mg，C18用量為150 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（200 mg）、D（300 mg）、E（400 mg）、F（500 mg）MgSO4。此處MgSO4的作用仍然是去除提取液中的水分，進樣溶液中如果水分含量高對儀器和柱子有損耗，也會降低柱效，影響實驗結果。實驗結果表明，MgSO4用量為200 mg時，各組分平均回收率最高（圖5）。

圖5 MgSO4用量對提取效率的影響Fig. 5 Effect of MgSO4 dosage on extraction efficiency

2.3.3 弗羅里硅土用量的選擇

實驗固定MgSO4用量為200 mg，C18用量為150 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（150 mg）、D（200 mg）、E（250 mg）、F（300 mg）弗羅里硅土。弗羅里硅土對極性干擾的吸附有很好的作用[30]，實驗發現，隨著弗羅里硅土用量的增加，各指標的回收率有的呈現先下降后上升的趨勢，有的指標變化不大，綜合各指標平均回收率和經濟因素，最終選用弗羅里硅土為50 mg，結果見圖6。

圖6 弗羅里硅土用量對提取效率的影響Fig. 6 Effect of Florisil dosage on extraction efficiency

2.4 基質效應的考察結果

基質效應是殘留檢測中普遍存在的現象，會對分析方法的重復性、靈敏度、準確度等產生影響，表現為基質抑制或增強效應?；|效應=基質匹配校準曲線的斜率/溶劑標準校準曲線的斜率[29]，基質效應越接近1，則基質效應越小，反之亦然，結果見表2。

表2 線性方程和基質效應Table 2 Linear equations and matrix effect ratio

由表2可以看出，pp’-DDT、op’-DDT、γ-HCH、β-HCH的基質效應較大，7 種多氯聯苯相對基質效應影響相對較小，實驗中可以采用配制基質標準曲線、加入分析保護劑、鹽析等降低基質效應的影響。本實驗中采用配制基質標準曲線降低基質效應。

2.5 檢出限、回收率、精密度實驗結果

實驗以3 倍信噪比計算檢出限。方法的準確度用回收率表示，添加量分別為0.5、5.0、50.0 μg/kg，每個添加水平重復測定6 次。方法的精密度用6 次平行測定的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。表3表明，目標成分檢出限為0.1～0.3 μg/kg，加標回收率范圍為85.5%～115.2%，RSD為3.5%～9.8%（n=6），低于10%。

表3 樣品的檢出限、平均回收率和RSDTable 3 LODs, average recoveries and RSDs of the method

3 結 論

本實驗通過對前處理方式、常用凈化劑的種類和用量等進行選擇和優化，建立了快速測定牛奶中有機氯及多氯聯苯殘留量的GC-MS/MS分析方法。方法簡單、快速、凈化效果好、靈敏度高、重復性好，可滿足牛奶中有機氯及多氯聯苯殘留量的快速篩查和定量分析要求。

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