冷凍除脂-氣相色譜-串聯質譜法檢測食用植物油中30 種多環芳烴

王國慶，王宗義*，程明捷，翟孟婷，馬蒙蒙，黃漫青

（北京農學院食品科學與工程學院，食品質量安全北京實驗室，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）是指分子中含有多個苯環的烴類化合物，主要有多苯代脂烴、聯苯和稠環芳烴[1]，是環境和食品較為關注的一類污染物，其中被美國環保署優先監測的有16 種，被歐盟法規列入的有15 種（含美國環保署優先監測中的8 種）[2]。由于PAH具有致癌、致畸和致突變作用[3]，食用油是PAH通過飲食進入人體的主要途徑之一[4]，PAH含量水平成為評價食用油質量安全的重要指標。目前，我國以苯并[a]芘作為食用油PAH污染的評價指標，限量為10 μg/kg[5]；歐盟則以苯并[a]芘，苯并[a]芘、苯并[a]蒽、屈及苯并[b]熒蒽4 種PAH的總和為評價指標，限量分別為2 μg/kg和10 μg/kg[6]；而食用油中PAH的國標檢測方法也只涉及16 種[7]。因此，研究多種PAH的高效檢測方法，對更為全面地監測和評價食用油中PAH的污染狀況，保證食用油質量安全具有重要意義。

PAH的檢測主要有高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜-質譜法[11-14]、液相色譜-串聯質譜法[15-17]和氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[18-19]，也有毛細管電泳法[20]的報道。其中，高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法較為常用，也是國標采用方法[21]，毛細管電泳實際應用則較少，液相色譜-串聯質譜法和GC-MS/MS則由于具有更好選擇性和檢出能力，為PAH的檢測提供新的有效手段。由于目標物含量低，克服以甘油脂為主體的樣品基質干擾，是檢測食用油中PAH的關鍵。通常需要經過溶劑提取，再使用凝膠滲透色譜法[22-24]、固相萃取[25-27]、固相微萃取[28]等方法進行凈化，或者使用在線凈化技術[29]等，方法相對繁瑣、成本也相對較高。

本研究使用超低溫冷凍除脂技術，以6 種氘標記PAH為內標，結合利用GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性，建立了樣品處理簡單、檢測食用植物油中30 種PAH的新方法，并進行了實際應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用油樣品，11 類38 個，其中20 個購自北京地區超市，18 個由中糧營養健康研究院提供。包括大豆油6 個、花生油4 個、調和油3 個、玉米油5 個、葵花油2 個、核桃油4 個、芝麻油6 個、橄欖油3 個、菜籽油3 個、亞麻籽油1 個及油茶籽油1 個。

萘（naphthalene，NAP）、1-甲基萘（1-methylnaphthalene，1-MNAP）、2-甲基萘（2-methylnaphthalene，2-MNAP）、聯苯（biphenyl，BIPH）、2,6-二甲基萘（2,6-bimethylnaphthalene，DMNAP）、苊烯（acenaphthylene，ACY）、苊（acenaphthene，ACE）、2,3,6-三甲基萘（2,3,6-trimethylnaphthalene，TMNAP）、芴（fluorene，FLU）、二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBTP）、菲（phenanthrene，PHE）、蒽（anthracene，ANT）、1-甲基菲（1-methylphenanthrene，1-MPHE）、熒蒽（fluoranthene，FLUR）、芘（pyrene，PYR）、苯并[a]蒽（benzo[a]anthracene，BAA）、屈（chrysene，CHR）、苯并[b]熒蒽（benzo[b]fluoranthene，BBF）、苯并[k]熒蒽（benzo[k]fluoranthene，BKF）、苯并[e]芘（benzo[e]pyrene，BEP）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BAP）、苝（perylene，PER）、茚并[1,2,3-c,d]芘（indeno[1,2,3-c,d]pyrene，ICDP）、二苯并[a,h]蒽（dibenz[a,h]anthrancene，DBAHA）和苯并[g,h,i]苝（benzo[g,h,i]perylene，BGHIP）二氯甲烷混合標準溶液（2 000 mg/L，1 mL），二苯并[a,h]芘（dibenzo[a,h]pyrene，DBAHP）二氯甲烷標準溶液（1 000 mg/L，1 mL），NAP-D8、ACE-D10、PHE-D10、CHR-D12、PER-D12二氯甲烷混合標準溶液（2 000 mg/L，1 mL），BAP-D12甲醇標準溶液（1 000 mg/L，1 mL） 美國o2si公司；環戊烯[c,d]芘（cyclopenta[c,d]pyrene，CPP）乙腈標準溶液（10 mg/L，1 mL）、二苯并[a,l]芘（dibenzo[a,l]pyrene，DBALP）環己烷標準溶液（10 mg/L，10 mL）、5-甲基屈（5-methylchrysene，5-MCHR）乙腈標準溶液（10 mg/L，10 mL）、二苯并[a,e]芘（dibenzo[a,e]pyrene，DBAEP）乙腈標準溶液（10 mg/L，10 mL） 德國Dr. Ehrenstorfer CmbH公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（均為色譜純） 美國J. T. Baker公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000C GC-MS/MS 美國Agilent Technologies公司；Centrifuge 5810 R高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；RE-2000B旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；BF-2000氮氣吹干儀 北京八方世紀科技有限公司；超低溫冰柜 北京德天佑科技發展有限公司；MS 3 basic渦旋混勻器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

用二氯甲烷將各定值標準溶液分別稀釋至10 mL容量瓶中，作為臨時儲備液于棕色貯液瓶中－20 ℃貯存，使用前于室溫放置30 min。用二氯甲烷稀釋臨時儲備液，得質量濃度分別為1、0.1 μg/mL的30 種PAH混合中間工作液和質量濃度為0.25 μg/mL的6 種穩定同位素標記的混合內標工作液，用于添加回收實驗和配制標準工作液。用二氯甲烷稀釋混合標準中間工作液和混合內標混合工作溶液，得質量濃度分別為1、5、10、25、50 ng/mL，內標質量濃度為10 ng/mL的標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取0.5 g食用油樣品于50 mL離心管中，加入40 μL 0.25 μg/mL 6 種PAH內標工作液及15 mL乙腈-丙酮（4∶1，V/V）混合液，于渦旋混合器上旋渦提取（2 000 r/min）5 min，10 000 r/min離心5 min使溶液充分分層后，于超低溫冰箱冷凍10 min，將上層清液倒入到雞心瓶中，40 ℃水浴中旋轉蒸發至大約1 mL，氮吹至近干，加入二氯甲烷1 mL，渦旋5 s，轉移至進樣瓶中，上機檢測。試劑空白樣，除不加樣品外，其他操作相同。

1.3.3 儀器分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至250 ℃，保持1 min；以8 ℃/min升至310 ℃，保持8 min。載氣（He，純度＞99.999%）流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：320 ℃；不分流進樣；進樣體積：1 μL。

1.3.3.2 質譜條件

離子源溫度為280 ℃，電離模式為電子電離源，溶劑延遲時間為6 min，傳輸線溫度為310 ℃，燈絲電流為35 μA，電子能量為70 eV，多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）檢測參數見表1。

表1 30 種PAH及6 種內標物的MRM參數Table 1 MRM parameters for 30 PAHs and 6 internal standards

2 結果與分析

2.1 樣品前處理

食用油中PAH的提取多選乙腈為溶劑，Zhou Ruize等[30]使用近80 倍樣品體積正己烷飽和的乙腈溶液提取食用油中的PAH，去除了脂肪，獲得良好效果；Thongsuk等[31]的研究表明，使用乙腈-丙酮溶液作提取劑，更有利于提高重質PAH的提取率。本實驗選擇使用乙腈-丙酮（4∶1，V/V）溶液為提取劑，考察樣品質量為0.5 g時，不同體積、不同渦旋時間PAH的提取效果。結果表明，在本研究確定的實驗條件下，即提取液用量為15 mL，渦旋時間為5 min，90%的PAH單次提取的回收率大于80%，滿足定量要求。

為了提高冷凍除脂的效率，本研究使用－80 ℃的超低溫冰柜進行冷凍，發現當冷凍時間小于5 min時，有機提取溶劑與油脂均為液態，冷凍時間大于15 min時，有機提取溶劑與油脂均為固態，冷凍時間為10 min左右時，下層油脂保持固態，上層提取液仍為液態，因此確定冷凍時間為10 min。冷凍后，上層提取液可方便地傾入雞心瓶中，實現與油脂充分分離。

旋轉蒸發剩余體積也是影響PAH檢測的重要因素，當旋蒸至近干時，NAP、2-MNAP、1-MNAP、BIPH、DMNAP損失較為嚴重，ACY、ACE、TMNAP也有一定的損失，因此，當旋蒸至1 mL左右時改用氮氣吹干，可有效避免上述損失。

2.2 GC-MS/MS檢測結果

對于色譜分離與質譜檢測條件的優化，在文獻[18-19,30]的基礎上，重點根據樣品基質的干擾情況對PAH離子對參數進行了優化，選擇干擾較小的離子對作為定量離子對，典型總離子流分離色譜圖如圖1所示，其中保留時間在23～26 min時共流出物干擾明顯，但各相應目標物離子對色譜峰于其保留時間處無明顯干擾，如圖1中的插圖所示。結果表明，本研究確定的提取和冷凍除脂方法，結合GC-MS/MS的高選擇性和檢出能力，能夠大為簡化食用油PAH檢測的樣品前處理，具有操作簡單、用時少且成本低的特點。

圖1 30 種PAH的總離子流與MRM色譜圖Fig. 1 TIC and MRM chromatograms of 30 PAHs

2.3 檢出限、定量限、線性考察結果

檢出限、定量限是通過對樣品和加標樣品中目標物定量離子對的信噪比不小于3和10，且定性離子對色譜峰可識別的前提下，估測而得，結果見表2，在取樣量為0.5 g的前提下，仍然獲得足夠的檢出能力，檢出限為0.1～1.83 μg/kg，定量限為0.35～6.11 μg/kg，優于國標方法[21]。考慮經樣品處理，最終樣品溶液中PAH的可能范圍，對PAH質量濃度為1～50 μg/L范圍進行了驗證，所有目標物均呈現良好的線性關系，R2大于0.998，見表2。

表2 30 種PAH的線性、檢出限與定量限Table 2 Linear ranges, LODs and LOQs for 30 PAHs

2.4 回收實驗和精密度實驗結果

通過對5、20 μg/kg和50 μg/kg添加量實驗，結果見表3，目標物測定相對標準偏差為1.18%～12.47%，回收率為67.77%～119.28%。

表3 30 種PAH的回收率及精密度（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations for 30 PAHs (n= 6)

續表3

2.5 實際樣品的應用

表4 食用油樣品中PAH含量的測定Table 4 Levels of PAHs in edible oil samples

應用本方法檢測了市售11 類38 個食用油樣品，每個樣品重復測定2 次，檢出率和含量范圍見表4，其中，芝麻油中未檢出ICDP、DBAHA和BGHIP，玉米油中未檢出DBAHA和DBALP，橄欖油和核桃油中未檢出PER、DBAHA和DBALP，亞麻籽油和油茶籽油中未檢出DBAHA和DBALP，所有樣品中均未檢出DBAEP和DBAHP；BAP含量在1.94～7.40 μg/kg之間，低于我國食用油國家標準的限量規定[5]；輕質PAH（含2～4芳香環，包括NAP、1-MNAP、2-MNAP、DMNAP、TMNAP、BIPH、ACY、ACE、FLU、DBTP、PHE、1-MPHE、ANT、FLUR、PYR、CPP、BAA、CHR和5-MCHR）含量在85.14～850.72 μg/kg之間，重質PAH（芳香環數不小于5，包括BBF、BKF、BEP、BAP、PER、ICDP、DBAHA、BGHIP、DBALP、DBAEP和DBAHP）含量在7.42～54.44 μg/kg之間，PAH總量在92.56～905.16 μg/kg之間。

3 結 論

本研究建立了冷凍除脂-GC-MS/MS檢測食用植物油中30 種PAH的新方法。方法具有樣品處理簡單，選擇性好，靈敏度高，定性、定量可靠等特點，可滿足對食用油中30 種PAH的監測的需要。通過市售食用植物油樣的檢測表明，依據我國相關限量標準，市售食用植物油PAH污染處于較安全水平。

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