釀酒酵母W5單倍體的制備及其代謝水平分析

王長麗，佟天奇，劉文娟，張云野，宋 剛，葛菁萍,*

近年來，利用國際公認安全微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產一些在食品、醫藥和能源等領域有著廣泛應用的平臺化合物受到研究者的極大關注[1-2]。作為模式生物，S. cerevisiae被認為是最具潛力的大規模生產菌種。但是，野生型S. cerevisiae的主產物為乙醇，而且其自身某些產物的代謝途徑被抑制或者不完整，故S. cerevisiae只能合成痕量的或者基本不產生目標產物，大多以其前體物質形式存在，如2,3-丁二醇[3-4]等。因此，若想有效地提高目標產物產量，必須提升原始菌株的生產性能。隨著分子生物學技術的飛速發展，人們對S. cerevisiae進行代謝工程改造，從而定向提高目標產物產量。改造思路主要集中在2 個方面[5-7]：一是敲除主產物代謝途徑中的關鍵酶基因；二是將目標產物途徑關鍵酶基因導入野生型S. cerevisiae中，誘導其過量表達。然而酵母細胞的優勢形態為二倍體[8]，無形中給菌株改造帶來了許多困擾。例如，在連續敲除二倍體S.cerevisiae細胞相關酶基因時，既增加了選擇抗性標記的困擾，又造成了菌株生長的壓力。而且目標基因導入二倍體酵母細胞后，在連續傳代過程中呈現出不穩定性。

研究表明，誘導S. cerevisiae產生子囊孢子進而分離單倍體是進行酵母代謝工程改造的重要手段之一，對于獲得穩定性和代謝性能均良好的工程菌株具有重要意義。酵母基因組倍性復雜，這是基因修飾后的菌株穩定性差的主要原因。單倍體酵母只有一套染色體，遺傳背景相對簡單，所以更適合作為代謝工程改造的出發菌株[9-11]。S.cerevisiae存在單倍體和二倍體2 種形態[12]，由于MAT基因座的信息差異，單倍體細胞被分為a和α兩種接合型，每種接合型的單倍體酵母細胞均可以產生外激素以吸引異性，因此二者可以交配形成二倍體細胞。但是在二倍體細胞中，這種交配應答是被抑制的[13]。此外，單倍體酵母細胞每經歷一個生命周期就會發生接合型轉換，這是由一種核酸內切酶的基因HO所誘導，其功能是在MAT交配型位點處產生特異性雙鏈斷裂，完成沉默的供體位點和活化位點之間的信息轉換，從而實現酵母細胞的同宗配合或異宗配合[14]。同宗配合菌株可以自我繁殖，由于HO作用將自身的母細胞轉變成與子細胞相反的配型進行交配[15]。另有研究表明二倍體產孢過程與減數分裂相關聯，在減數分裂I期，同源染色體聯會非姐妹染色單體交叉互換，促進染色體上的基因發生重排[16-17]，使得篩選性狀較好的單倍體細胞成為可能。

本研究以S. cerevisiae為出發菌株，旨在獲得1株生長性能好、碳源流向乙醇途徑相對減弱的單倍體S. cerevisiae菌株，使其能更多地積累目的產物2,3-丁二醇的前體物質乙偶姻。選取不同的產孢培養基進行產孢實驗，確定最適的產孢培養基；利用隨機孢子分析法[18]和MAT-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法[19]分離并鑒定單倍體菌株；通過連續傳代培養，觀察單倍體細胞及菌落形態，鑒定是否含有HO，并從代謝水平上研究單倍體菌株的代謝物變化情況，最終選取主產物途徑被削減，目標產物或其前體物質含量增加的單倍體，為后續實驗的進行做好準備工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與菌株

Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液 上海生物工程有限公司；蝸牛酶 上海藍季科技發展有限公司；β-巰基乙醇、NaCl、脫色液（3%酸性乙醇溶液）、番紅花紅T天津市科密歐化學試劑有限公司；TritonX-100 上海索萊寶生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 上海翊圣生物科技有限公司；石碳酸復紅、呂氏美蘭 南京森貝伽生物科技有限公司；孔雀石綠 天津市天新精細化工開發中心；生物素 武漢艾美捷科技有限公司；肌醇 天津市光復精細化工研究所；琥珀酸 天津市致遠化學試劑有限公司；Taq DNA polymerase、dNTP Mixture 天根生化科技有限公司。

本實驗所用菌株見表1，其中S. cerevisiae W5用作單倍體分離，標準單倍體S. cerevisiae W303-1A[20]用于鑒定單倍體。酵母細胞培養條件為30 ℃、140 r/min。

表1 實驗所用菌株基因型與來源Table 1 Yeast strains used in this study

1.1.2 培養基

YPD培養基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水定容至1 L，108 ℃滅菌20 min，瓊脂粉20 g/L，用于S. cerevisiae W5的培養。改良YPD培養基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母提取物8 g/L，25 mg/L ZnSO4·7H2O，108 ℃高壓濕熱滅菌20 min，瓊脂粉20 g/L，用于產孢前S. cerevisiae W5培養。

產孢培養基[9,21]：McClary培養基：酵母粉2.5 g/L、KCl 1.8 g/L、乙酸鈉8.2 g/L、瓊脂粉20 g/L；Kleyn培養基：蛋白胨2.5 g/L、NaCl 0.62 g/L、乙酸鈉5 g/L、瓊脂粉20 g/L；SPM培養基：酵母粉2.5 g/L、乙酸鉀10 g/L、KH2PO41 g/L、瓊脂粉20 g/L；改良SPM培養基：在SPM培養基上補加23.6 g/L琥珀酸，0.125 g/L ZnSO4·7H2O，2 μg/L生物素，100 μg/L肌醇，pH 6.0；醋酸鹽培養基：酵母粉2.5 g/L、乙酸鈉8.2 g/L、pH 4.8，瓊脂粉20 g/L；改良醋酸鹽培養基：在醋酸鹽培養基基礎上補加23.6 g/L琥珀酸，0.125 g/L ZnSO4·7H2O，2 μg/L生物素，100 μg/L肌醇，pH 4.8。用于S. cerevisiae W5產孢培養。

發酵培養基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨20 g/L、無氨基酸酵母氮源3.4 g/L、KH2PO411.8 g/L、K2HPO43 g/L、(NH4)2SO410 g/L、pH 5.0，108 ℃滅菌20 min，用于酵母菌葡萄糖搖瓶發酵。

1.1.3 引物

MAT-PCR法用于鑒定單倍體，HO用于單倍體穩定性的研究，涉及的引物見表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 驗證單雙倍體的引物Table 2 List of primers used to verify haploid and diploid

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；BX43正置熒光顯微鏡 美國Olympus有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；22R臺式離心機 美國Beckman公司；XB-K-25血球計數板上海市求精生化試劑儀器有限公司；DK-S24恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳產孢培養基的篩選

將活化好的S. cerevisiae W5接種于改良YPD培養基上，30 ℃培養2～3 d，直至單菌落出現。挑取單菌落轉接于產孢培養基上，30 ℃培養3～10 d，每天定量取樣鏡檢，觀察孢子的形成情況，采用血球計數法計算產孢率和孢子釋放率，分別按公式（1）和（2）進行計算：

通過產孢率確定最佳的培養時間，并通過孔雀石綠-番紅對子囊孢子進行染色，驗證孢子的產生情況。

1.3.2 誘導S. cerevisiae W5單倍體分離、富集和驗證

參照文獻[22-23]分離方法，利用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋孢子菌懸液（1×108CFU/mL），吸取2 mL，6 000 r/min離心5 min，重復2 次。向收集菌體中加入蝸牛酶液（均含1%巰基乙醇，起始的蝸牛酶質量濃度為100 mg/mL），終質量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/mL，分別于37 ℃恒溫水浴0.5、1、2、4、8、10 h，每20 min振蕩一次，取樣鏡檢，觀察不同蝸牛酶質量濃度對子囊孢子破壁的影響，并計算孢子釋放率。子囊孢子破壁結束后，9 700×g離心1 min，收集菌體，加入400 μL 0.5% TritonX-100和4 μL 10 mmol/L DTT重懸菌液，58 ℃熱激10 min，4 ℃離心收集孢子，溶于2 mL STD溶液（0.1 g NaCl溶于10 mL 0.05% TritonX-100），梯度稀釋10－5、10－6、10－7倍后涂布于YPD平板上。培養3 d，挑取較小的菌落進行MAT-PCR，并進行形態學觀察。其中PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30 個循環；72 ℃ 10 min。反應體系：含Mg2＋10×Taq Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，MAT-F、MAT-a、MAT-α各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 4.5 μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。

1.3.3 單倍體菌株傳代培養與鑒定

將分離得到的單倍體以5%接種量接種至YPD液體培養基中，培養10 代，利用PCR法擴增HO基因。具體反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行30 個循環；72 ℃ 10 min。反應體系：含Mg2＋10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，HO-up和HO-down各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 17 μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL。

1.3.4 單倍體菌株的搖瓶發酵性能測定

將菌株接種到YPD液體培養基中，30 ℃、140 r/min培養至對數生長期，以5%接種量分別轉接至150/500 mL發酵培養基中，30 ℃、150 r/min培養72 h，每6 h取3 mL，測定其OD600nm和pH值。同時取樣1 mL，稀釋100 倍，12 000 r/min離心10 min，利用HPLC檢測葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸和乙偶姻含量。

1.4 數據統計

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗，P小于0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 最佳產孢培養基的選擇

2.1.1 培養基和培養時間對S. cerevisiae W5產孢率的影響

如圖1所示，S. cerevisiae W5在6 種產孢培養基中，產孢率由大到小分別是改良SPM培養基＞改良醋酸鹽培養基＞醋酸鹽培養基＞SPM培養基＞McClary培養基＞Kleyn培養基，因此改良SPM培養基比較適合S. cerevisiae W5。S. cerevisiae W5在改良SPM培養基上產孢率最高為（35.57±0.82）%。除Kleyn培養基外其他培養基均能使原始菌株W5產孢，產孢率隨培養時間的延長先上升后趨于平穩，5～8 d時產孢率明顯增高，培養至10 d時子囊孢子生長基本停止。因此，選擇培養至8 d時的子囊孢子較好，此時孢子產量和活性較高。

圖1 不同產孢培養基（A）和培養時間（B）對酵母W5產孢率的影響Fig. 1 Effects of different culture media (A) and culture time (B) on sporulation rate of S. cerevisiae W5

2.1.2 S. cerevisiae W5產孢驗證結果

圖2 孔雀石綠-番紅染色的顯微觀察（×1 600）Fig. 2 Microscopic examination of S. cerevisiae W5 with malachite green-safranine staining (× 1 600)

如圖2所示，S. cerevisiae W5的孢子多數為3 孢和2 孢，只有在SPM培養基或改良SPM培養基中有少數的4 孢產生，這說明細胞完成了減數分裂II期，即“四聯體”階段。染色結果可以清楚地觀察到改良SPM培養基有少量4 個子囊孢子的形成，這進一步說明生物素和肌醇的添加促進了細胞完成減數分裂II期。所以，改良SPM培養基是S. cerevisiae W5的最佳產孢培養基，并成功驗證了培養8 d時，S. cerevisiae W5的產孢情況。

2.2 單倍體的制備結果

2.2.1 蝸牛酶質量濃度對S. cerevisiae W5孢子釋放率的影響

表3 不同蝸牛酶質量濃度處理不同時間對孢子釋放率的影響Table 3 Effect of snailase concentration on spore release rate

由表3可知，蝸牛酶質量濃度的差異對S. cerevisiae W5子囊孢子的釋放率有較大影響，S. cerevisiae W5的孢子釋放率隨蝸牛酶質量濃度的增加而先增高后降低；相同質量濃度下，隨處理時間的延長，孢子釋放率也呈現出先增后降的特點，處理10 h時尤為明顯。可能原因在于酶解時間過長，使子囊孢子的孢子壁再次裂解。所以最終選擇終質量濃度為30 mg/mL時的蝸牛酶處理2 h為最佳破壁條件。

2.2.2 單倍體菌株的分離與鑒定

子囊孢子分離和富集后在YPD培養基上形成若干單菌落，隨機挑取較小的單菌落，由MAT-PCR法鑒定，由圖3可知，404 bp處條帶為MAT-α型，544 bp處條帶為MAT-a型，而兩處均有條帶的則為二倍體菌株。將鑒定配型后的菌株活化，并按照圖3數字順序命名菌株為H1～H16。理想狀態下單倍體菌株性能穩定，生長良好，產乙醇能力能夠適當減弱，使更多的碳源流向乙偶姻，與原始菌株W5相比，積累量有一定的提高。

圖3 單倍體與二倍體的PCR擴增驗證結果Fig. 3 Identification of haploid and diploid strains by PCR amplification

2.3 單倍體菌株篩選

將鑒定為單倍體的菌株經連續傳代后發現有7 株較為穩定，分別為S. cerevisiae H1/H2/H5/H6/H14/H8/H9。其中，S. cerevisiae H1/H2/H5/H6/H8為MAT-α型，S. cerevisiae H14/H9則為MAT-a型。PCR擴增HO，如圖4所示，除S. cerevisiae H14（MAT-a）外，均在1 772 bp處出現清晰的條帶，與理論值一致。

圖4 單倍體HO的PCR擴增結果Fig. 4 PCR amplification of HO of seven haploid strains

為了驗證S. cerevisiae H14（MAT-a）是否存在HO，再次以原始菌株W5基因組DNA為陽性對照，H2O為陰性對照，PCR擴增HO。如圖5和圖6所示，陽性對照組在1 772 bp處有清晰條帶，而S. cerevisiae H14和陰性對照組均沒有條帶，表明S. cerevisiae H14確實為HO缺失株。原因可能是二倍體（MAT-a/α）存在隱性致死基因，在減數分裂過程中導致基因缺失。

圖5 單倍體HO PCR擴增結果Fig. 5 PCR amplification of HO of haploid H14

圖6 單倍體及二倍體的PCR擴增驗證結果Fig. 6 PCR amplification of haploid H14 and diploid W5

2.4 顯微形態觀察

圖7 顯微形態觀察Fig. 7 Microscopic observations of S. cerevisiae H14 and S. cerevisiae W5

如圖7所示，S. cerevisiae H14（MAT-a）細胞呈圓球形、小（3～6 μm）、易聚集在一起；菌落為乳白色、呈隆起狀、濕潤、邊緣光滑。而S. cerevisiae W5細胞較大（5～10 μm）分散、呈橢圓形，菌落直徑為0.5～0.6 cm。

2.5 單倍體發酵性能檢測結果

圖8 S. cerevisiae H14和S. cerevisiae W5發酵性能Fig. 8 Fermentation curves of S. cerevisiae H14 and S. cerevisiae W5

由圖8可知，隨著葡萄糖的消耗，菌體大量繁殖，單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）生長速率略低于S. cerevisiae W5（MAT-a/α），但二者差異不顯著（P＞0.05）。在整個發酵過程中，S. cerevisiae W5的乙醇質量濃度始終高于單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）。S. cerevisiae H14在發酵30 h乙醇質量濃度達到最大為（40.46±1.06）g/L，較S. cerevisiae W5發酵24 h乙醇最大質量濃度（（51.65±2.39）g/L）下降了21.67%（P＜0.05）。

但S. cerevisiae H14（MAT-a）乙酸和乙偶姻質量濃度高于S. cerevisiae W5，在發酵24 h時，分別較S. cerevisiae W5提高了12.70%和57.14%（P＜0.05）。pH值則呈現先降低后趨于平穩的趨勢，且S. cerevisiae H14（MAT-a）略高于S. cerevisiae W5。而甘油在發酵過程中呈先升后降趨勢，在發酵30 h，S. cerevisiae H14（MAT-a）甘油質量濃度要高于S. cerevisiae W5，并較其提高了60.14%（P＜0.05），這意味著乙醇質量濃度的變化影響了代謝途徑中其他副產物的變化，原因可能是S. cerevisiae倍型的改變對其代謝途徑產生了影響，減少了主產物乙醇的合成，又提高了其他產物的含量，如乙酸、乙偶姻、甘油等。

3 討 論

進行酵母代謝工程改造和遺傳學研究尤為關鍵的一步是誘導酵母產孢[23-24]從而分離單倍體，這既是遺傳分析的必需因素，又可為親本的雜交[23,25]提供條件。原因在于它僅有一套染色體，減少了基因敲除過程中回復突變的概率[11]。S. cerevisiae子囊孢子的形成過程中有兩個重要因素[8]：一是營養條件匱乏；二是出發菌株為二倍體。營養匱乏與產孢培養基成分顯著相關，在碳源豐富的改良YPD培養基中，葡萄糖可以提供孢子形成的碳源骨架和細胞減數分裂的能量，并促進前體物質的合成。而以醋酸鹽為碳源的產孢培養基能夠促使酵母產孢，并通過添加少量的維生素，可以在一定程度上提高產孢率。此外，肌醇和生物素同樣利于3 孢子或4 孢子的形成，可見孢子萌發過程十分復雜，并且受很多因素影響[26]。當環境中碳、氮源匱乏時[9]，適當添加非發酵碳源（如醋酸等），能夠誘導孢子的生成[15]。因此本實驗所選擇的6 種產孢培養基均缺乏碳源且無機鹽豐富。其中最適合S.cerevisiae W5產孢的改良SPM培養基，是在SPM培養基基礎上添加了琥珀酸、Zn2＋、生物素和肌醇等物質。琥珀酸可以維持內部pH值的動態平衡，Zn2＋則可以提高酵母細胞減數分裂II期過程中關鍵酶的活性，并增加胞內3 孢子或4 孢子的生成數量，生物素和肌醇能夠促進酵母細胞順利完成減數分裂II期。

在獲得最適產孢培養基后，對S. cerevisiae W5進行產孢培養及孢子的分離。孢子的生長過程分為準備階段、基因重組、孢子生成轉換3 個階段[16,27-28]，孢子的分離通常采用四分子分析和隨機孢子分析，由于S. cerevisiae四分子的子囊形成較少，所以本實驗采用隨機孢子分析法對S. cerevisiae W5進行單倍體的分離。實驗過程中鑒于單倍體和二倍體耐熱性的差異，采用高溫滅活營養細胞的方法[22,24]分離單倍體，經過MAT-PCR法鑒定及連續傳代培養后共獲得7 株單倍體，PCR擴增后獲得1株HO缺失的穩定傳代單倍體菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）。該菌株經PCR鑒定屬于異宗配合的單倍體，能以單倍體形式穩定繁殖，只有在特定環境[29-30]中（即存在與其自身相反配型）才能雜交形成二倍體細胞[15]。搖瓶發酵實驗表明，由于S. cerevisiae H14（MAT-a）為單倍體菌株，其生長率略低于S. cerevisiae W5，但二者差異并不顯著（P＞0.05），而S. cerevisiae W5積累量顯著高于S.cerevisiae H14（MAT-a）（P＜0.05），S. cerevisiae H14（MAT-a）的乙酸、乙偶姻的產量較S. cerevisiae W5分別提高了12.7%和57.14%，可能是由于乙酸上升導致酸度增加，一定程度上影響菌株生長，與乙醇的積累呈非偶合關系。綜上可知，當菌株S. cerevisiae H14（MAT-a）的乙醇產量降低時，菌體生長卻變化不大，足以說明菌體碳源分流向其他代謝途徑，大量積累副產物乙酸、乙偶姻。乙偶姻產量上升更加證實了這一觀點，同時乙偶姻因反饋調節，中和乙酸帶來的酸性作用，致使S.cerevisiae H14（MAT-a）的pH值較S. cerevisiae W5相對提高。本實驗通過以S. cerevisiae W5為出發菌株制備篩選的S. cerevisiae H14（MAT-a）較為理想，為S. cerevisiae單倍體的制備提供了研究經驗，也豐富了酵母遺傳學研究的理論基礎。

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