蘋果轉錄因子MdHB1的原核表達與多克隆抗體制備

戴杰雨，姜永華，張玉潔，王豪杰，劉瀟然，劉翠華，任小林*

HD-Zip家族是植物特有的一類轉錄因子，因其含有同源異型盒（homeobox domain，HD）與亮氨酸拉鏈結構（leucine zipper，Zip）而得名。其結構與動物中的HDZip蛋白有所不同，表明很可能在高等植物的生長發育過程中具有不同尋常的意義[1]。HD-ZipI亞家族的成員可能是整個家族中被研究最多的，從植物種子的發育[2]、花的開放與衰老[3-4]到果實的發育至衰老[3,5]等一系列生長發育事件都有研究報道[6-7]。眾多研究表明，HD-ZipI通過植物激素的信號轉導，參與植物逆境脅迫的響應；并且被發現既有正調控也有負調控，是植物蛋白高級結構的一部分[7-9]。因此，HD-ZipI亞家族在植物的生命周期中發揮著重要的調控作用。

模式植物番茄中，LeHB-1作為LeACO1的轉錄因子，通過與其互作調控乙烯的合成，進而影響番茄果實成熟衰老的進程[3]。于巧平等[10]通過BLAST蘋果EST庫獲得了目標EST序列，從澳洲青萍花器總cDNA中克隆到了MdHB1全長序列；蘋果MdHB1屬于HD-ZipI亞家族，被認為是MdACO1的轉錄因子。李興亮[11]發現，MdHB1與MdSnRK2.4功能域STKC（Ser/Thr protein kinasec）發生物理互作，使自身功能域HD被蛋白磷酸化修飾，引起MdACO1啟動子活性的改變而影響乙烯的合成；這與以前的研究者推測其參與蘋果果實的成熟與衰老進程相吻合，病毒誘導沉默實驗結果也支持這一結論[12]。本實驗室前期探索了該基因在蘋果的不同器官、不同發育時期的表達模式，結果表明在嘎啦的花瓣和花后40 d表達水平較高[13]；通過構建酵母雙雜交cDNA文庫，篩選了與MdHB1互作的多個蛋白，涉及植物的脅迫響應、能量代謝、光合作用等，表明MdHB1在蘋果生長發育過程中功能廣泛[14]；通過β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因瞬時表達實驗等分析了MdHB1基因啟動子中乙烯響應元件，表明乙烯可以誘導MdHB1的表達[15]。綜上，MdHB1很可能與其他家族成員類似，廣泛參與蘋果生長發育的調控與環境脅迫的響應。目前關于功能的研究主要是通過轉錄水平的變化來揭示，而轉錄因子最終是以蛋白的形式執行功能的，因此蛋白方面的研究對于揭示MdHB1的功能十分必要。本研究利用大腸桿菌得到原核表達的MdHB1融合蛋白，Ni-NTA親和柱純化后作為抗原制備多克隆抗體；通過Western Blot實驗和間接酶聯免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實驗，結果表明所得多克隆抗體效價較高，特異性良好，不僅能從菌體總蛋白中特異性識別MdHB1，也能從蘋果幼葉總蛋白中成功檢測MdHB1蛋白，為進一步研究MdHB1提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果葉片采集于西北農林科技大學園藝場，品種為“澳洲青萍”。選取幼嫩新生葉，采集后隨即帶回實驗室，液氮速凍，－80 ℃保存備用。

蛋白原核表達載體pGEX-6p-1和pET-28a（＋）本實驗室保存；表達菌株BL2（DE3） 北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶（BamHI，EcoRI，SalI）、T4連接酶試劑盒（DNA Ligation Kit）、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、核酸Marker（DL2000）大連TaKaRa有限公司；植物膜蛋白提取試劑盒 上海貝博生物有限公司；蛋白分子質量標準 北京全式金生物技術有限公司；兔抗Anti-GST抗體 北京博奧森生物技術有限公司；辣根氧化酶標記的二抗（羊抗兔IgGHRP） 西安沃爾森生物技術公司；辣根過氧化酶化學發光試劑盒 賽默飛世兒科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀、DYCZ-40G型轉印電泳儀 北京六一儀器廠；JY88-IIN超聲破碎儀寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MdHB1蛋白結構預測

在NCBI數據庫中搜索MdHB1基因獲得其cDNA序列（GenBank：JQ678788.1），在線軟件Conserved Domains Search Tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）用來預測基因的保守區域。利用DNASTAR對蛋白的二級結構及其柔韌性進行預測。蛋白三維結構同源建模在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）用來構建MdHB1蛋白的三維結構。TRMHMM server v.2.0（http://www. cbs.dtu.d k/services/TMHMM-2.0/）預測蛋白的跨膜區域。

1.3.2 引物的設計與基因片段克隆

根據得到的MdHB1序列，利用Primer 5.0設計所需要的引物。設計引物MdHB1-A1（5’-CGGGATCC ATGATGGAGCCGGGCCG-3’，下劃線處為BamHI酶切位點）和MdHB1-S1（5’-CGGAATTCTTATGACC ATCCCCACCAGTTCA-3’，下劃線處為EcoRI酶切位點），用于連接pGEX-6p1-1載體。設計引物MdHB1-A2（5’-CCGGAATTCATGGAGCCGGGCCGTT-3’,下劃線處為EcoRI酶切位點），與MdHB1-S2（5’-ACGC GTCGACTTATGACCATCCCCACCAGTT-3’，下劃線處為SalI酶切位點），用于連接pET-28a（＋）載體。此外，用于檢測MdHB1全長的引物為MdHB1-F（5’-AGTTGTTTAGCTGGAAAAGAGATG-3’）和MdHB1-R（5’-CAATTTAGGGGATTTAGCCATTT AT-3’）。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司負責合成。

前期，于巧平等[10]以澳洲青萍的花器為材料，從其cDNA中克隆到了蘋果MdACO1的轉錄因子MdHB1基因。在此利用澳洲青萍的cDNA為模板，分別以MdHB1-（A1，S1）和MdHB1-（A2，S2）為引物進行基因擴增。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）為上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Es TaqMasterMix 25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR程序為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終止延伸5 min；程序進行擴增30個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用DNA回收試劑盒回收相應大小產物。

1.3.3 原核表達載體構建

MdHB1-（A1，S1）克隆回收的DNA產物經過BamHI和EcoRI雙酶切后與經過同樣酶切處理的pGEX-6p-1載體相連接，得到重組質粒pGEX-6p-1-MdHB1（命名為6pHB）；同理，將MdHB1-（A2，S2）的基因克隆產物經過EcoRI和SalI雙酶切后連入pET-28a（＋）載體,獲得重組質粒pET-28a-MdHB1（命名為28aHB）。而后分別轉入大腸桿菌感受態DH5α，經過菌液PCR和質粒PCR檢測后，再通過測序驗證重組載體中基因序列的正確性。

1.3.4 表達載體6pHB在大腸桿菌中的表達

提取質粒6pHB和空載pGEX-6p-1，分別轉入大腸桿菌感受態BL21（DE3），挑取生長健壯陽性菌株于LB液體培養基培養。37 ℃搖床200 r/min培養菌液OD600nm至0.7～0.8后，按照終質量濃度50 mg/L的量加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導蛋白的表達8 h。離心收集菌體，移除上清液，按10 mL PBS/g菌體的量重懸菌體；利用超聲破碎儀進行菌體細胞破碎，程序為：30%的能量，工作0.5 s，間歇2.5 s，破碎10 min；液氮速凍，存于－80 ℃備用。

1.3.5 MdHB1融合蛋白的可溶性分析與表達條件的優化

取6pHB陽性菌株于37 ℃、200 r/min振蕩培養OD600nm至0.7～0.8，加入終質量濃度50 mg/L IPTG，混合均勻后分別取10 mL于18、28、37 ℃，200 r/min振蕩培養8 h，收集，裂解菌體。再次離心，上清液存入新的離心管，沉淀中加入與上清液等體積的PBS重懸液并振蕩均勻。

在28 ℃條件下，終質量濃度50 mg/L IPTG振蕩培養大腸桿菌0、2、4、6、8、10 h；終質量濃度10 mg/L和100 mg/L的IPTG誘導表達融合蛋白8 h；收集，裂解菌體。

以上樣品分別上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離檢測。

1.3.6 表達載體28aHB的誘導表達與蛋白純化

重組質粒28aHB在大腸桿菌中的誘導表達過程如1.3.4節中的描述基本一致。誘導6 h的28aHB菌體，12 000×g、5 min離心收集，充分裂解后，按照Novagen公司的Ni-NTA His-bind resin親合柱的使用說明洗脫收集蛋白。并將純化前后的蛋白，Ni-NTA柱不吸附的穿柱蛋白液等用10% SDS-PAGE分離，SDS-PAGE檢測其純化效果。

1.3.7 多克隆抗體的制備

將純化后的蛋白樣品（MdHB1-His6）作為抗原，送往上海近岸蛋白科技有限公司進行多克隆抗體制備。

1.3.8 間接ELISA法檢測抗體效價

抗原以50 mmol/L酸鹽包被緩沖液稀釋，每孔加入量為100 ng，4 ℃過夜；5%脫脂奶粉封閉液37 ℃封閉1 h；分別加入按照1 000、4 000、8 000 倍比例稀釋的抗體；37 ℃孵育1 h；洗滌，加入稀釋2 000 倍的IgGHRP二抗，37 ℃孵育1 h；最后加入以四甲基聯苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）為底物的顯色液，室溫下暗室處理5 min，50 μL終止液（2 mol/L H2SO4溶液）終止顯色，酶標儀測定酶標板各孔的OD450nm。其中以包被液作為空白對照，以免疫前的陰性血作為陰性對照。

1.3.9 Western Blot實驗檢測抗體的特異性

經10% SDS-PAGE分離6pHB菌株的總蛋白后，電壓100 V、1 h濕轉至0.45 μm的聚偏氟乙?。╬olyvinylidene fluoride，PVDF）膜上,在含有5%脫脂奶粉的鹽酸緩沖液（Tris-HCl-tween20，TBST）中4 ℃輕搖1 h封閉。用TBST稍加漂洗，分別以自制的Anti-MdHB1多克隆抗體和Anti-GST單克隆抗體為一抗，1∶2 000用TBST稀釋后，置于4 ℃靜止過夜。次日TBST洗滌3 次，每次10 min，再加入連有辣根氧化酶的羊抗兔IgG-HRP進行二抗孵育45 min。再次以大量的TBST漂洗3 次后，加入化學發光底物進行顯色拍照。澳洲青萍幼葉蛋白的提取利用植物膜蛋白提取試劑盒，Western Blot實驗操作基本與上述相同。

2 結果與分析

2.1 MdHB1的生物信息學分析

利用已經公布的MdHB1蛋白推導序列，預測蛋白的結構。保守區域預測在線軟件Conserved Domains Search的結果說明MdHB1屬于HD-ZipI亞家族。利用DNASTAR通過Garnier-Robson和Deleage-Roux兩種方法預測MdHB1的二級結構，其結果顯示各種結構所占比例大約為：α-螺旋47%，β-折疊24%，無規則卷曲20%，β-轉角不超過10%；Karplus-Schulz方法預測的蛋白柔韌性區域約占整體的62.5%。利用在線三維結構預測軟件SWISSMODEL形成的3D模型，其模板是人同源異形盒蛋白PRH（2m0c.1.A），兩者的相似性為47.37%（圖1）。此外，TRMHMM server v.2.0預測MdHB1無跨膜區域。

圖1 MdHB1蛋白的生物信息學分析Fig. 1 Predicted structure of MdHB1 protein

2.2 質粒28aHB的構建

在制備抗體時，較小的標簽蛋白對于制備多克隆抗體的影響更小。選用了pET-28a（＋）表達載體，其中含有His基因，誘導表達后目的蛋白中帶有6×His標簽蛋白（His6-tag）。純化融合蛋白，進而作為抗原制備抗體。如圖2所示，重組質粒28aHB的特異性條帶明顯高于空載；而在EcoRI和SalI雙酶切后，在4 000～7 000 bp之間兩者的特異性條帶位置一致，并且重組質粒在1 000 bp左右有一條特異性條帶，這與MdHB1的理論值一致。通過膠回收1 000 bp左右的條帶，測序檢驗，確定為MdHB1序列。至此，28aHB重組質粒構建成功。

圖2 重組表達載體28aHB的雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant expression vector 28aHB by double enzyme digestion

2.3 重組質粒28aHB的表達與蛋白純化

將28aHB載體轉化至大腸桿菌感受態BL21（DE3），37 ℃、200 r/min誘導培養轉菌株8 h后，離心收集，破碎菌體，SDS-PAGE上樣檢測。誘導后的28aHB在55 kDa處有明顯的特異性條帶，這比預測的融合蛋白MdHB1-His6分子質量（44.4 kDa）略高，可能的原因是由于蛋白表達過程中自身的修飾，也有可能如唐威華等[16]的研究所述，由于His6-tag的存在，降低了融合蛋白的遷移速率。破碎后的菌體離心，分離上清液與沉淀；電泳顯示37 ℃誘導下，該融合蛋白絕大部分以包涵體的形式存在于沉淀中。通過Ni-NTA柱分離，洗脫，洗脫液中的融合蛋白條帶明顯，且只有一條明顯的特異性條帶，說明蛋白純化成功（圖3）。

圖3 重組質粒28aHB的表達與蛋白純化Fig. 3 Expression of recombinant plasmid 28aHB and protein purification

2.4 間接ELISA法測定多克隆抗體的效價

由圖4可知，包被液（空白對照）和兩個陰性對照（未免疫血）與抗原均無明顯的陽性反應；而分別稀釋1 000、4 000、8 000 倍的抗血清都產生了明顯的反應，OD450nm都大于0.5，說明制備的多克隆抗體效果良好。

圖4 間接ELISA法測定多克隆抗體的效價結果Fig. 4 Titer of polyclonal antibody determined by indirect ELISA

2.5 原核表達載體6pHB的構建

在進行多克隆抗體的特異性檢測時，為了對其進行交叉檢測，將MdHB1連接入另一個表達載體pGEX-6p-1（其中帶有GST基因），構建6pHB載體，在大腸桿菌中誘導表達得到了MdHB1-GST融合蛋白，并優化了其的表達條件。提取重組質粒6pHB，用本實驗所設計的引物MdHB1-（F，R）進行PCR驗證，如圖5所示，在構建好的6pHB重組質粒中克隆出了1 000 bp左右的特異性條帶。BamHI和EcoRI雙酶切重組質粒得到兩條特異性條帶，其中一條1 000 bp左右，這與驗證引物克隆出的特異性條帶的大小基本一致，并符合對MdHB1大小的預期；另外一條特異性條帶的大小位于4 000～7 000 bp之間，這個大小與BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-6p-1空載得到的特異性條帶大小基本一致。未進行雙酶切的6pHB和pGEX-6p-1載體作為對照，與其雙酶切結果相比，條帶顯示的位置都要分別低于酶切后的特異性條帶，驗證了環狀DNA的電泳速度要快于開環DNA的結論；并且重組質粒6pHB的分子質量明顯大于空載。綜合以上結果，原核表達質粒6pHB構建成功。

圖5 重組表達載體6pHB酶切鑒定Fig. 5 Identification of the recombinant expression vector 6pHB by double enzyme digestion

2.6 重組質粒6pHB的原核表達

重組質粒6pHB轉化至大腸桿菌感受態BL21（DE3），終質量濃度50 mg/L的IPTG誘導培養8 h，離心收集菌體，裂解后上樣進行SDS-PAGE。其中轉入空載pGEX-6p-1的大腸桿菌作為對照，進行同樣的操作。結果顯示，重組質粒在66.2 kDa處有一處明顯的蛋白聚集，這與預測的重組蛋白的分子大?。?4.4 kDa）基本符合；空載的蛋白在25～35 kDa之間有一條明顯的特異性條帶，這與標簽蛋白GST的蛋白分子大?。?6 kDa）基本一致（圖6）。這些表明，通過誘導大腸桿菌，得到了6pHB表達后帶有GST-tag的融合蛋白（MdHB1-GST）。

圖6 6pHB誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis showing the induced expression of 6pHB in E. coli

2.7 融合蛋白MdHB1-GST的可溶性分析

相同質量濃度誘導劑（50 mg/L）的條件下，不同溫度誘導培養轉化6pHB的大腸桿菌，經過菌體破碎，離心，分離上清液，重懸沉淀，分別得到了18、28 ℃和37 ℃誘導8 h菌體總蛋白的沉淀和上清液。如圖7所示，18 ℃和28 ℃的上清液中，70 kDa附近明顯的特異條帶明顯亮于37 ℃的上清液；而三者的沉淀中所含的融合蛋白MdHB1-GST都比上清液中的量要多，37 ℃誘導下差異最為明顯。這些說明該融合蛋白更多以包涵體的形式存在于沉淀中，并且較低的誘導溫度（18 ℃和28 ℃）更有利于MdHB1-GST可溶性形式的表達。

圖7 不同溫度誘導下融合蛋白MdHB1-GST可溶性分析Fig. 7 Analysis of soluble MdHB1-GST fusion protein at different temperatures

2.8 誘導時間和誘導物質量濃度對融合蛋白MdHB1-GST表達的影響

28 ℃條件下，終質量濃度50 mg/L的IPTG誘導轉化6pHB的大腸桿菌表達用以探索表達時間對蛋白表達量的影響，不同質量濃度的IPTG誘導培養8 h探索誘導物質量濃度對融合蛋白表達量的影響。經過SDS-PAGE分析，融合蛋白的表達量隨著時間的延長有所增加，培養至8 h表達量基本達到了最大；而終質量濃度10、50、100 mg/L的誘導劑對于融合蛋白最終表達量影響不大（圖8）。

圖8 不同誘導培養時間和IPTG質量濃度對融合蛋白MdHB1-GST表達的影響Fig. 8 Effects of culture time and IPTG concentration on expression of recombinant MdHB1-GST

2.9 多克隆抗體特異性檢測結果

2.9.1 菌體總蛋白的Western Blot實驗

圖9 菌體總蛋白的Western Blot實驗結果Fig. 9 Western Blot analysis of total bacterial protein

轉化6pHB的大腸桿菌誘導表達后破碎獲得其菌體總蛋白，經SDS-PAGE，電濕轉至PVDF膜上進行Western Blot雜交實驗。1、2兩條帶顯示，以自制的Anti-MdHB1為一抗時，在50～70 kDa之間有一條明顯的特異條帶，其分子質量大小符合對融合蛋白MdHB1-GST預期；3、4泳道是以兔抗Anti-GST單克隆抗體為一抗進行的雜交實驗，其條帶位置與多克隆抗體雜交條帶是一致的（圖9）。這說明多克隆抗體能夠特異性的檢測到融合蛋白MdHB1-GST，并且也證明了6pHB表達的融合蛋白的正確性。

2.9.2 蘋果幼葉蛋白Western Blot實驗

利用植物蛋白提取試劑盒提取澳洲青萍幼葉蛋白，取30 μL蛋白樣品SDS-PAGE分離，轉膜進行Western Blot實驗。如圖10所示，在70～100 kDa之間檢測出一條明顯的特異性條帶，這與MdHB1蛋白二聚體的分子質量基本相符（38.4 kDa×2）。由此證明，自制Anti-MdHB1多克隆抗體能夠從植物組織中特異性的檢測到目的蛋白，且效果良好。

圖10 蘋果幼葉蛋白的Western Blot實驗結果Fig. 10 Western Blot analysis of proteins in young apple levels

3 討 論

本實驗利用實驗室前期克隆的MdHB1序列，首先利用一系列生物信息學軟件對其結構進行了預測，結果表明，蘋果轉錄因子MdHB1含有其特有的HD結構和Zip結構，是HD-ZipI亞家族的成員；兩種二級結構預測方法得到的各結構所占比例基本一致，并且發現目的蛋白的柔韌性區域所占比例很高。蛋白的柔韌區域對于其功能有著很重要的作用，例如催化、結合、變構效應等[17]。當前研究表明，該家族成員多通過參與植物激素的信號轉導，響應外界各種環境因素的刺激，影響植物生長發育的進程，例如水稻中，HD-ZipI亞家族成員Oshox22影響了ABA的合成，并通過ABA介導的信號轉導參與水分和鹽脅迫[7-9,18-22]；其較多的柔韌區域可能與這些響應有關，是各種生理響應的分子基礎，正如一些研究者所認為，HD-ZipI是植物高級蛋白結構的一部分[7]。此外，預測并沒有發現目的蛋白有跨膜區域；作為植物轉錄因子，大部分研究認為其HD-Zip家族的亞細胞定位在細胞核[6,23-24]，然而筆者最近研究發現，MdHB1的亞細胞定位不僅在細胞核，也存在于細胞膜，這可能和其自身的蛋白功能有關。

要制備高質量的抗體，理想的免疫原是前提。通過大腸桿菌原核表達目的蛋白，不僅操作簡單，并且有成本低、周期短的優點。本研究構建了兩種原核表達載體：6pHB和28aHB；前者帶有分子質量較大的GST-tag，后者為較小的His6-tag。通過一系列的SDS-PAGE分析，探索了溫度、誘導時間、誘導物質量濃度對融合蛋白MdHB1-GST誘導表達的影響。在進行兔的免疫制備抗體時，選用pET-28a（＋）載體，His6-tag分子質量小，免疫影響弱，不影響蛋白的自身活性，并且后期的純化和鑒定也較為方便[25]。通過SDS-PAGE分析原核表達菌體總蛋白的上清液和沉淀，發現在37 ℃下，兩種形式的融合蛋白大部分以包涵體的形式存在；即使在較低溫度下誘導表達，MdHB1-GST可溶性融合蛋白的量有所上升，但仍然不及沉淀中包涵體的量大。一些蛋白在較低的溫度下原核表達的可溶性大大增加，遠超以包涵體形式存在的融合蛋白[26]，而MdHB1卻達不到這樣的效果，可能與其蛋白本身的結構有關。

Western Blot實驗是驗證特異抗體與相應蛋白互作的一種常用方法，具有反應靈敏、所需試材少等優點。通過該實驗發現，自制的Anti-MdHB1多克隆抗體與菌體總蛋白雜交后，背景較低，條帶清晰；也能夠成功地從植物組織中成功檢測到目的蛋白，且背景較低。間接ELISA表明，在抗體稀釋8 000 倍的情況下，抗體OD460nm仍然較高，即所制多克隆抗體的效價較高。綜上，自制得到的Anti-MdHB1多克隆抗體特異性良好，能夠用于后續蛋白相關的研究。

在蘋果葉片蛋白的Western Blot實驗中，所得條帶在70～100 kDa之間，這與預測的MdHB1的分子質量大?。?8.4 kDa）相差較大，基本接近其二倍的分子質量大小。在以前的研究中，從植物體得到的成熟蛋白與預測蛋白分子質量存在差異的情況并不少[26-28]，并且從理論上講也是極有可能的。一種可能是植物中蛋白質的修飾作用，植物體存在的蛋白不同與原核表達系統較為簡單的環境，成熟的蛋白經過一系列修飾才能起作用，例如糖基化[27]；另一種是蛋白以二聚體或者多聚體的形式存在于植物組織中，多個研究表明，HD-Zip通過Zip結構域形成二聚體，然后HD結構域與特定DNA序列結合發揮轉錄因子的作用[29-31]，而在原核表達系統無法表現出來；故MdHB1在植物中所存在的功能形式還需要進一步的研究確定。

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