基于SPME-GC-MS法比較新疆哈薩克族不同居住區奶酪風味差異

鄭曉吉，劉 飛，任全路，李寶坤，李開雄，諸葛斌*

（1.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 241112；2.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；3.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003）

我國新疆地區地域廣袤、少數民族眾多。豐富的養殖業造成多樣乳品的出現，如干酪、半成熟干酪、奶豆腐等加工產品。新疆哈薩克族主要分布在伊犁哈薩克自治州、阿勒泰、塔城及木壘哈薩克自治縣和巴里坤哈薩克自治縣等。奶酪是哈薩克族傳統發酵乳制品之一，風味獨特，營養豐富。與西方奶酪相比，哈薩克族奶酪屬于傳統自然發酵，因地域、氣候條件、制作工藝的不同，奶酪風味迥異。奶酪的風味主要來源于大多數揮發性化合物如酸類、醇類、酯類、酮類、醛類、萜烯類化合物等，而且不同奶酪具有獨特的揮發性組分[1-3]。目前，西方不同奶酪風味物質的研究較多[4-5]，在特征風味分析方面已形成了系統的研究體系[6]。Uregeghe等[7]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用技術對一種意大利奶酪中揮發性成分進行檢測，發現其風味成分主要由羧酸、酯、酮和醇等一些小分子化合物組成。張碩等[8]研究地區添加內源性脂肪酶奶酪中揮發性成分物質增加，風味也得到改善。衣宇佳[9]研究干酪不同成熟期的風味組分變化，干酪成熟至90 d時，2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2-庚酮、2-壬酮、異丁酸、戊酸和癸酸為其特征風味組分貢獻較大的化合物。目前我國傳統奶酪風味方面的研究工作已經初步開展[10-15]，但對于新疆哈薩克少數民族不同地區傳統奶酪風味組分方面的研究較少。新疆哈薩克族奶酪產品風味物質形成機制不明晰、風味品質不穩定等科學問題已成為產品標準化生產的瓶頸，嚴重制約了手工制作向產業化加工轉化的進程。本實驗以新疆不同地區的哈薩克族奶酪為研究對象，采用SPME-GC-MS解析形成奶酪風味的特征化合物，為開發適合于新疆哈薩克族民族奶酪的加工制作提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯苯（色譜純）、正構烷烴（C6～C30，色譜純）美國Sigma-Aldrich公司。

奶酪樣品（表1）取自新疆北疆主要的哈薩克居住地區，如伊犁、阿勒泰、塔城和哈密地區。所有樣品貼上標簽后置于車載的－4 ℃冰箱內冷藏，12 h之內運回實驗室，于4 ℃保存。

表1 不同哈薩克族居住區奶酪樣品采集信息Table 1 Information about different Kazak cheese samples

1.2 儀器與設備

SCION SQ 456 GC-MS聯用儀、DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Bruker公司；65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50 μm/30 mm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME條件[16-17]

第1次使用GC萃取頭時，需對進樣口進行250 ℃老化1～2 h。第2次使用老化15～20 min，去除可吸附的揮發性物質。取20 mL頂空瓶加入5 g樣品，將75 μm CAR/PDMS萃取頭老化后插入樣品瓶頂空部分，50 ℃吸附30 min，將萃取頭吸附后取出，插入GC進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時開啟儀器收集數據。

1.3.2 GC-MS檢測條件

載氣：高純氦氣；恒流模式0.8 mL/min；自動進樣器：無分流進樣1 μL；色譜柱：DB-WAX毛細管柱；程序升溫：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至90 ℃加熱1 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃加熱7 min；離子源溫度230 ℃，電子電離源；采用多離子監測掃描模式，電子能量70 eV。

1.3.3 揮發性化合物定性

GC-MS測定的數據由儀器自帶的系統軟件（Xcalibur）進行分析處理，將奶酪樣品中揮發性成分經計算機檢索并與商業計算機譜庫WILEY和NIST分析比對后，只記錄匹配度不小于800的揮發性物質[16-19]。

1.3.4 揮發性化合物的定量

對揮發性物質鑒定進行半定量分析，按下式進行計算：

揮發性化合物質量濃度/（mg/L）=（揮發性化合物峰面積/內標物峰面積）×內標物質量濃度

1.4 數據分析

采用SPSS軟件進行數據統計分析，聚類分析采用R語言軟件處理。

2 結果與分析

2.1 GC-MS檢測結果

SPME能有效地吸附樣品中的揮發性組分，新疆北部20 種不同哈薩克主要居住地區奶酪樣品中，經SPME-GC-MS中共檢測出52 種主要的揮發性風味成分，其中酸類8 種，醇類14 種，酯類16 種，醛類6 種，酮類4 種，萜烯類2 種，其他類化合物2 種。各類風味物質種類和相對含量見表2。

20 種奶酪樣品中揮發性風味物質種類多且復雜，不同地區樣品的風味物質種類和含量存在一定的差異。從揮發性風味物質種類分析，其中伊犁地區昭蘇縣奶酪（Y1）中鑒定出52 種化合物，以酯類、酸類和醇類化合物為主；特克斯縣（Y2）中得到46 種化合物，酯類和醇類物質相對含量較高。阿爾泰地區可可托海、吉木乃以及塔城地區奶酪風味物質相似度較高，其中脂肪酸類化合物含量居多，其次是酯類化合物。塔城地區托里奶酪主要含酸類、酯類和醇類化合物；塔城和布克賽爾奶酪中含有48 種揮發性化合物，脂肪酸類化合物、酯類化合物相對含量較高，酮類化合物含量明顯高于其他樣品。阿勒泰地區布爾津樣品（A1）揮發性化合物種類和含量較低，因其樣品硬度較高，可能影響了取樣后的萃取效果。

2.2 揮發性風味物質主成分分析和聚類分析

圖1 不同地區奶酪主成分分析圖Fig. 1 Principal component analysis of flavor compounds in Kazak cheeses

對新疆哈薩克族主要居住區20 種奶酪中52 種揮發性風味成分進行主成分分析。由圖1可知，20 種不同地區奶酪通過風味物質差異可以分為3 組，伊犁地區（昭蘇、特克斯縣、伊寧、那拉提和鞏留）和哈密地區（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉）奶酪風味物質差異顯著，得到明顯區分。阿勒泰（布爾津、切木爾切克鄉、可可托海、吉木乃和阿勒泰）和塔城地區（托里多拉特鄉、和豐、和布克賽爾、托里和額敏）奶酪風味成分相似度較高，歸為一類。

表2 新疆不同哈薩克族居住區奶酪樣品中揮發性組分質量濃度Table 2 Relative concentrations of volatile components from different Kazak cheese samples mg/L

由表2和圖2可知，不同地區哈薩克族奶酪共同風味物質包括酸類（乙酸、丁酸、庚酸、辛酸）、醇類（乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇）、酯類（乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二甲酯）、酮類（2-壬酮、2-庚酮、乙偶姻）、醛類（正己醛、庚醛、壬醛）。影響20 種不同地區奶酪差異的風味化合物主要為乙酸（AC1）、丁酸（AC3）、己酸（AC6）、乙醇（AL1）、3-甲基-1-丁醇（AL5）、2-苯乙醇（AL14）、乙酸乙酯（ES1）、己酸乙酯（ES10）、辛酸乙酯（ES12）、乙酸-2-苯乙酯（ES14）、庚醛（CB2）、壬醛（CB3）、2-庚酮（CB7）、2-壬酮（CB10）。其中壬醛是哈密地區鹽池鄉H5樣品與其他樣品之間差異的主要成分，乙酸是造成伊犁地區樣品與其他樣品之間差異的主要成分，2-壬酮是導致哈密巴里坤H1樣品與其他樣品之間差異的主要特征成分。

伊犁地區樣品主要風味物質為乙酸、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-丁醇、2-羥基丙酸乙酯和2-甲基丙醇，區別于其他地區樣品。由圖2可知，伊犁地區奶酪乙酸含量明顯高于其他地區樣品，而1-辛烯-3-醇含量明顯低于哈密地區和其他奶酪樣品，而哈密地區樣品醇類物質3-甲基-1-丁醇明顯低于其他地區。哈密地區（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉）樣品中，巴里坤（H1）風味物質良好，明顯區別于同地區其他樣品。主要區別在醛類（己醛、2-庚醛、壬醛、苯甲醛）、酯類物質（丙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-丙烯酸丁酯、丁酸丁酯）和2-壬酮。

圖2 不同地區風味物質聚類分析熱圖Fig. 2 Heat map obtained from clustering analysis of flavor compoundsin different Kazak cheeses

2.3 不同揮發性物質的風味分析

圖3 不同地區樣品感官分析結果Fig. 3 Sensory analysis of cheeses from different regions

對20 種不同地區奶酪進行10 個指標（酸味、刺激味、甜味、咸味、肉湯味、鮮味、堅果味、蒸煮味、顆粒感和干燥程度）進行感官評價，由圖3可知，不同地區奶酪感官分析主要差異在于酸味、刺激味和干燥程度。

2.3.1 脂肪酸類化合物

脂肪酸類物質對于奶酪的風味具有重要影響，奶酪發酵和成熟過程中乳脂肪或氨基酸降解形成一系列的中、短碳鏈的脂肪酸（碳原子數大于4），是奶酪最典型的特征風味組分，也是評價奶酪成熟程度的重要標志之一[20-21]。奶酪成熟過程中，脂肪酸類化合物主要來源于3 個主要的生化途徑：1）脂肪水解（甘油三酯水解成脂肪酸）；2）蛋白質降解（酪蛋白降解成小分子肽和氨基酸）；3）乳糖發酵。其中乳糖經過微生物的代謝形成奶酪的主要風味物質如乙酸和丙酸[13]。丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等與脂肪水解有關。此外，2-甲基丙酸和3-甲基-丁酸經氨基酸代謝形成。乙酸是大多數奶酪的特征風味之一，給予奶酪、胡椒、水果和花的氣味。伊犁地區奶酪乙酸含量明顯高于其他地區樣品，伊犁地區伊寧市（Y3）樣品酸類物質如己酸、丁酸、辛酸和庚酸含量較高。己酸具有刺激味，是奶酪發酵過程中乳脂肪降解產生的。此外丁酸在不同地區奶酪中相對含量也較高，是原料乳中固有的脂肪酸，常常賦予奶酪特殊的酸臭味。阿爾泰地區布爾津（A1）風味物質檢測結果顯示，丁酸含量明顯高于其他樣品，在感官評定中酸臭味較高，和GC-MS數據分析一致。

2.3.2 酯類化合物

奶酪中酯類物質是乳脂肪降解產生的短鏈脂肪酸及中長鏈脂肪酸與發酵過程中乳糖發酵或氨基酸代謝產生的伯醇及仲醇發生酯化反應產生[22]。奶酪中的酯類化合物賦予奶酪甜味、水果香和花香，因而該類化合物對奶酪特征香氣的形成具有重要作用。酯類化合物如乙酸乙酯能夠賦予奶酪發酵香氣，減少由脂肪酸類化合物賦予的刺激氣味，使奶酪更加柔和[23-27]。辛酸乙酯賦予奶酪酯香和酒香，己酸乙酯能夠增強奶酪的果香和酒香。

20 種奶酪樣品中，共有的酯類物質有乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等，是哈薩克族奶酪中的特征風味組分。此外乙酸-2-苯乙酯和3-甲基-1-丁醇乙酸酯為不同地區奶酪中相對含量較高成分，為奶酪中脂肪酸與相應的醇類發生酯化反應的產物。伊犁地區不同樣品中辛酸乙酯含量明顯高于其他地區奶酪樣品，與奶酪感官特性結果相吻合。

2.3.3 醛類化合物

奶酪中醛類化合物的形成途徑通過脂肪酸代謝、氨基酸轉氨基作用或Strecker降解[1,11]。醛類化合物易被還原成相應的醇，因此在奶酪中的含量相對都不高。20 種不同地區奶酪中，醛類物質主要以庚醛、己醛和壬醛為主，已有研究表明奶酪中較常見的直鏈醛類如己醛、壬醛，一般具有青草味和霉腐味，其含量一旦超過某個閾值就會產生令人不愉快的氣味，影響奶酪感官品質[22]。哈密巴里坤（H1）樣品中醛類物質如壬醛、庚醛和己醛相對含量明顯高于其他地區。

2.3.4 酮類化合物

酮類化合物風味獨特，其中甲基酮類物質在脂肪酸β氧化的過程中形成，為乳制品中特征風味組分。酮類化合物賦予奶酪水果味、花香味及霉腐味[23,25]。20 種不同地區奶酪中揮發性風味分析結果表明，奶酪中酮類物質相對較少，主要以2-庚酮、2-壬酮和乙偶姻居多。哈密地區奶酪中的酮類化合物的含量明顯高于其他地區，以2-壬酮和2-庚酮為主，這類化合物可以賦予奶酪微甜的脂蠟香氣，使其風味變得更為豐滿，與感官分析結果相吻合。

2.3.5 醇類化合物

奶酪中醇類化合物的形成主要通過甲基酮和醛類還原、乳糖代謝、氨基酸代謝以及脂肪酸的降解[23]。不同地區哈薩克族奶酪中，醇類物質所占比例最高也是最普遍的風味成分。乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、正己醇、2-庚醇和1-辛醇在大部分哈薩克奶酪中均能檢測到，其中伊犁地區特克斯縣（Y2）樣品乙醇和3-甲基丁醇相對含量最高。

3-甲基-1-丁醇為新疆哈薩克族不同地區奶酪中共有的含量較高的醇類之一，奶酪成熟過程中蛋白質分解形成的亮氨酸通過Strecker降解，經轉氨、脫羧、還原形成[1]。3-甲基-1-丁醇也是馬蘇里拉奶酪和其他羊奶奶酪中主要醇類物質[21,24,28]。苯乙醇在不同奶酪樣品中廣泛存在，尤其伊犁昭蘇（Y1）樣品含量最高。苯乙醇是由苯丙氨酸經酵母菌代謝形成[29-30]，賦予奶酪的玫瑰香和發酵香，對新疆哈薩克族奶酪風味貢獻較大。

3 結 論

不同地區20 種奶酪樣品中經感官分析結合SPMEGC-MS顯示，20 種奶酪樣品中共檢測出52 種主要揮發性化合物，共有的風味物質包括酸類（乙酸、丁酸、庚酸、辛酸），醇類（乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇），酯類（乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二甲酯），酮類（2-壬酮、2-庚酮、乙偶姻），醛類（正己醛、庚醛、壬醛）等。因地域、氣候條件、制作工藝的不同，奶酪風味迥異。其中主成分分析顯示不同地區奶酪的揮發性風味組分差別較大，和不同地區相吻合，其中伊犁地區（昭蘇、特克斯縣、伊寧、那拉提和鞏留）和哈密地區（巴里坤、伊吾縣、口門子和鹽池鄉）奶酪風味物質差異顯著，得到明顯區分。阿勒泰（布爾津、切木爾切克鄉、可可托海、吉木乃和阿勒泰）和塔城地區（托里多拉特鄉、和豐、和布克賽爾、托里和額敏）奶酪風味成分相似度較高，歸為一類。伊犁地區樣品主要風味物質為乙酸、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-丁醇、2-羥基丙酸乙酯和2-甲基丙醇，相對含量高于其他地區樣品。哈密地區樣品中，巴里坤（H1）風味物質良好，明顯區別于同地區其他樣品。其醛類（己醛、2-庚醛、壬醛、苯甲醛）、酯類物質（丙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、2-丙烯酸丁酯、丁酸丁酯）和2-壬酮的相對含量高于其他地區樣品。

參考文獻：

[1] FOX P F, GUINEE T P, COGAN T M, et al. Fundamentals of cheese science[M]. 2nd ed. New York: Springer, 2017.

[2] AYANA I A A A, EL-DEEB A M. Quality enhancement of edamlike cheese made from goat’s milk[J]. American Journal of Food Technology, 2016, 11: 44-53. DOI:10.3923/ajft.2016.44.53.

[3] OZTURKOGLU-BUDAK S, GURSOY A, AYKAS D P, et al. Volatile compound profiling of Turkish Divle Cave cheese during production and ripening[J]. Journal of Dairy Science, 2016, 99(7): 5120-5131.DOI:10.3168/jds.2015-10828.

[4] CéCILE C, CéLINE D, FRéDéRIQUE D. Application of SSCPPCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2006, 29(2): 172-180.DOI:10.1016/j.syapm.2005.07.008.

[5] S?RENSEN L M, GORI K, PETERSEN M A, et al. Flavour compound production by Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae and Debaryomyces hansenii in a cheese-surface model[J].International Dairy Journal, 2011, 21(12): 970-978. DOI:10.1016/j.idairyj.2011.06.005.

[6] NOGUEIRA M C L, LUBACHEVSKY G, RANKIN S A. A study of the volatile composition of Minas cheese[J]. Lebensm Wissu Technology, 2005, 38(5): 555-563. DOI:10.1016/j.lwt.2004.07.019.

[7] URGEGHE P P, PIGA C, ADDIS M, et al. SPME/GC-MS characterization of the volatile fraction of an Italian PDO sheep cheese to prevalent lypolitic ripening: the case of Fiore Sardo[J]. Food Analytical Methods, 2012, 5(4): 723-730. DOI:10.1007/s12161-011-9302-5.

[8] 張碩, 王玉田, 孟鑫. 內源性脂肪酶對奶酪風味的作用及風味成分分析[J]. 食品工業科技, 2013, 34(6): 100-104. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.06.054.

[9] 衣宇佳. 國產類契達干酪的風味研究[D]. 無錫: 江南大學, 2008:6-26.

[10] 郭萌萌. 硬質干酪加工工藝及風味物質的研究[D]. 煙臺: 煙臺大學,2014: 15-45.

[11] 王蓓, 張國華, 王娟, 等. SPME-GC-MS分析內蒙古地區傳統奶豆腐中揮發性風味組分[J]. 現代食品科技, 2015, 31(12): 378-386.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.12.056.

[12] 馬艷麗, 曹雁平, 楊貞耐, 等. SPME-GC-MS檢測不同中西方奶酪的揮發性風味物質及比較[J]. 食品科學, 2013, 34(20): 103-107.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201320020.

[13] DELGADO F J, GONZáLEZ-CRESPO J, CAVA R, et al. Formation of the aroma of a raw goat milk cheese during maturation analysed by SPME-GC-MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1156-1163.DOI:10.1016/j.foodchem.2011.05.096.

[14] 江麗紅, 周穎喆, 洪青. 市售陳年切達奶酪風味特征及消費者喜好度研究[J]. 食品工業科技, 2014, 35(23): 275-279. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.23.050.

[15] 馬艷麗, 曹雁平, 鄭福平, 等. 奶酪的風味組分研究進展[J]. 中國乳品工業, 2013, 41(5): 36-39.

[16] ZHENG X J, LI K X, ZHUGE B, et al. Potential characterization of yeasts isolated from Kazak artisanal cheese to produce flavoring compounds[J]. Microbiologyopen, 2018, 7(1): e00533. DOI:10.1002/mbo3.533.

[17] ZHENG X J, LIU F, ZHUGE B, et al. Dynamic correlations between microbiota succession and flavor development involved in the ripening of Kazak artisanal cheese[J]. Food Research International, 2018, 105:733-742. DOI:10.1016/j.foodres.2017.12.007.

[18] ZHU J C, CHEN F, WANG L Y, et al. Evaluation of the synergism among volatile compounds in Oolong tea infusion by odour threshold with sensory analysis and E-nose[J]. Food Chemistry, 2017, 221:1484-1490. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.11.002.

[19] LI N, ZHENG F P, CHEN H T, et al. Identification of volatile components in Chinese Sinkiang fermented camel milk using SAFE, SDE, and HS-SPME-GC/MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1242-1252.DOI:10.1016/j.foodchem.2011.03.115.

[20] XU E, LONG J, WU Z, et al. A characterization of volatile flavor compounds in Chinese rice wine fermented from enzymatic extruded rice[J]. Journal of Food Science, 2015, 80(7): 1476-1489.DOI:10.1111/1750-3841.12935.

[21] DRAKE M A, MIRACLE R E, MCMAHON D J. Influence of fat on flavour and flavour development in Cheddar cheese[J]. Australian Journal of Dairy Technology, 2010, 65(3): 195-199.

[22] ORDIALES E, MARTíN A, BENITO M J, et al. Role of the microbial population on the flavor of the soft-bodied cheese Torta del Casar[J].Journal of Dairy Science, 2013, 96(9): 5477-5486. DOI:10.3168/jds.2013-6587.

[23] CURIONI P M G, BOSSET J O. Key odorants in various cheese types as determined by gas chromatography-olfactometry[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(12): 959-984. DOI:10.1016/S0958-6946(02)00124-3.

[24] MCSWEENEY P L H. Biochemistry of cheese ripening[J].International Journal of Dairy Technology, 2004, 57(3): 127-144.

[25] MOLIMARD P, SPINNLER H E. Review: compounds involved in the flavor of surface mold-ripened cheeses-origins and properties[J].Journal of Dairy Science, 1996, 79(2): 169-184. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(96)76348-8.

[26] FOX P F, MCSWEENEY P L H, UNIACKE-LOWE T, et al. Dairy chemistry and biochemistry[M]. Switzerland: Springer, 2015: 499-545.

[27] CASTILLO I, CALVO M V, ALONSO L, et al. Changes in lipolysis and volatile fraction of a goat cheese manufactured employing a hygienized rennet paste and a defined strain starter[J]. Food Chemistry,2007, 100(2): 590-598. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.09.081.

[28] NOGUEIRA M C L, LUBACHEVSKY G, RANKIN S A. A study of the volatile composition of Minas cheese[J]. LWT-Food Science and Technology, 2005, 38(5): 555-563. DOI:10.1016/j.lwt.2004.07.019.

[29] PLUTOWSKA B, WARDENCKI W. Aromagrams-aromatic profiles in the appreciation of food quality[J]. Food Chemistry, 2007, 101: 845-872.DOI:10.1016/j.foodchem.2005.12.028.

[30] MARTIN N, BERGER C, SPINNLER H E. Sensory and instrumental flavor analyses of cheese curd cocultured with selected yeast and bacteria[J]. Journal of Sensory Studies, 2002, 17(1): 1-17.DOI:10.1111/j.1745-459X.2002.tb00328.x.