OAV和GC-O-MS法分析五香驢肉風味活性物質

謝 恬，王 丹，馬明娟，陳海濤*，孫寶國，張 寧，張玉玉

驢肉肉質細嫩，味道香醇，具有獨特的風味，并且驢肉含脂量為5.0%，低于其他畜禽肉的脂肪含量，不飽和脂肪酸含量高于其他畜禽肉，能夠提供豐富的不飽和脂肪酸[1]，較好地滿足人體的營養需求，因此受到大眾喜愛。但是由于地域限制，許多地區的市場上沒有驢肉的相關產品。利用真空包裝技術將驢肉變成即食食品，不僅保證產品感官風味和營養成分，而且方便運輸、攜帶，突破了地域限制。目前對于驢肉的研究主要集中于驢肉脂肪酸的組成及功能評價、驢肉制品的工藝研究等，而對于驢肉獨特的風味研究較少，為確定真空包裝五香驢肉的關鍵性風味活性物質，本實驗擬對真空包裝五香驢肉的揮發性風味物質進行研究。

溶劑輔助風味蒸發（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）法是一種能夠有效把揮發性成分從復雜基質中提取出來的方法，具有對樣品的熱敏性揮發成分破壞較小、萃取物的香味自然逼真的優點[2]，常用于果蔬[3]、肉制品[4]中的風味物質分析。氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）法將GC的分離能力與人類鼻子的靈敏性相結合，使研究者可對揮發性風味物質進行定性定量評價，并能夠確定特定的風味物質在某一濃度條件下是否具有風味活性，風味活性的持續時間及其強度和香型等風味信息。風味物質是否對整體風味有貢獻不僅取決于濃度的大小，還與其閾值有關，閾值指單個揮發性物質產生嗅覺反應需要的最低濃度[5]。Rothe等[6]定義了香氣活性值（odor activity value，OAV），它是風味物質濃度與其閾值的比值。化合物的OAV不小于1，則認為該化合物對其風味有貢獻作用，且OAV越大，對整體風味的貢獻度就越大[7]。因此可通過OAV確定風味物質對整體風味貢獻的大小。

本實驗通過SAFE法結合GC-O-MS技術分析鑒定真空包裝五香驢肉中的風味物質，采用內標法定量，結合OAV，找到關鍵性風味活性物質，為真空包裝五香驢肉的生產加工、質量控制及風味評價提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五香鬧湯驢肉（250 g） 河南省老師傅食品發展有限公司。

二氯甲烷、無水硫酸鈉、鄰二氯苯（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；C6～C30正構烷烴（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；氮氣（純度99.9%）北京氦普北分氣體工業有限公司；2-甲基-3巰基呋喃、芳樟醇、麥芽酚、2-甲基吡嗪、壬醛、2,6-二甲基吡嗪、醋酸、葉醇、甲基庚烯酮（質量分數均為99.9%）北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

溶劑輔助揮發性香氣蒸發裝置 北京肯堡博美玻璃儀器廠；XDS5復合渦輪分子泵 英國Edwards公司；A-100S旋轉蒸發儀 日本EYELA公司；SHB-III循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；OLS系列多功能水浴搖床 英國固藍特儀器有限公司；ISQ1310 GC-MS聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；ODP3嗅聞檢測器 德國Gerstal公司；感官評定杯東莞市萬江鑫誠玻璃制品廠。

1.3 方法

1.3.1 SAFE提取揮發性風味物質

準確稱取100 g切碎的驢肉，放入500 mL錐形瓶中，加入300 mL二氯甲烷，用封口膜封口并經搖床振蕩（轉速110 r/min，溫度25 ℃）12 h后，經抽濾得到有機相約300 mL。將萃取液倒入滴液漏斗內，超級恒溫水槽和循環水的溫度設置為50 ℃，在冷阱和保溫瓶內加入液氮，當系統壓力降至5 MPa左右時，打開滴液漏斗的活塞，緩慢滴加，萃取約40 min。收集的萃取液中加入無水硫酸鈉，置于－18 ℃冰箱中干燥12 h，過濾，旋轉蒸發濃縮至1.5～2.0 mL，氮吹至1 mL，待GC-MS聯用分析。

1.3.2 GC-O-MS分析

采用GC-O-MS對驢肉揮發性風味物質進行分析，該系統由ISQ1310 GC-MS和ODP3嗅聞裝置組成。樣品經進樣口解吸，經GC分離后分別進入質譜檢測器和嗅聞檢測器，分流比為1∶1。由6 名經過訓練的實驗人員在嗅聞口記錄所聞到的香味特征和強度（1=微弱的氣味，2=中等強度的氣味，3=強烈的氣味）。須有3 人以上嗅聞到才能被確定為風味活性物質。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：DB-Wax毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持1 min；以6 ℃/min升溫至100 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.2 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍45～550 u；全掃描；溶劑延遲時間5 min；調諧文件為標準調諧。

1.3.4 定性定量分析

定性分析：以NIST 11譜庫檢索，保留指數（retention index，RI）定性對檢測結果進行分析，結合相關文獻進行人工譜圖解析。RI是在分析樣品中添加了C6～C30正構烷烴內標物后按公式（1）計算：

式中：t’（i）為待測組分的調整保留時間（t’（n）＜t’（i）＜t’（n＋1））/min；n和n＋1分別為未知物流出前、后正構烷烴的碳原子數；t’（n）和t’（n＋1）分別為具有n和n＋1個碳原子的正構烷烴的保留時間/min。

定量分析：對驢肉中揮發性風味物質進行分離鑒定時添加鄰二氯苯（質量濃度為65 μg/mL，溶劑為二氯甲烷）為內標物。根據鄰二氯苯的質量濃度與體積、揮發性風味物質的色譜峰面積與鄰二氯苯的色譜峰面積進行比較，按公式（2）計算揮發性風味物質相對于鄰二氯苯的含量，認定內標的因子為1[8]。

式中：Ci為未知化合物的含量/（μg/g）；Si為鄰二氯苯的質量濃度/（μg/mL）；CA為未知化合物的峰面積；SA為鄰二氯苯的峰面積；Vi為萃取液的體積/mL；no/i為混合液中所含的內標物體積與萃取液體積之比；ms為前處理前樣品的質量/g。

1.3.5 OAV計算

按公式（3）計算OAV：

式中：Ci為化合物的含量/（μg/g）；OTi為該化合物在水中的嗅覺閾值/（mg/kg）。

1.3.6 感官評定

表1 五香驢肉的風味感官評定的描述詞、定義及參照物Table 1 Vocabulary, definition and reference for flavor sensory attributes of spiced donkey meat

采用定量描述性感官評價法[9]，確定五香驢肉風味感官描述詞，采用數字評估法對五香驢肉中每一項風味指標的強度進行評分。評定人員根據GB/T 162912—2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則》[10]進行培訓。

將5 g樣品置于感官評定杯中，由12 名（6 男6 女）評定人員進行感官評定，評定的具體指標、定義及標準香味化合物參照見表1。評定人員對不同質量濃度的標準香氣化合物按濃度從低至高進行嗅聞，再對樣品進行嗅聞，將其進行比較并評分。采用Excel 2010進行數據處理，結果采用平均值表示，并繪制風味剖面圖。

2 結果與分析

2.1 五香驢肉揮發性風味物質的GC-MS結果分析

圖1 SAFE萃取五香驢肉中揮發性物質的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of volatile aroma compounds in spiced donkey meat extracted by SAFE

續表2

采用SAFE提取五香驢肉中的揮發性風味物質，如圖1、表2所示，共鑒定出48 種物質，包括烴類4 種，醇類14 種，酚類1 種，醛類7 種，酮類4 種，酸類5 種，酯類6 種，醚類1 種，雜環及其他類6 種。其中含量最高的為雜環及其他類化合物，含量為3.714 μg/g，其次為醇類（3.266 μg/g）、醚類（1.365 μg/g）、酸類（0.785 μg/g）、烴類（0.596 μg/g）、酯類（0.514 μg/g）、酚類（0.413 μg/g）、醛類（0.167 μg/g）、酮類（0.134 μg/g），含量高低并不能說明對風味的貢獻度大小[11]，需結合GC-O-MS結果與OAV進行進一步分析。

2.2 五香驢肉風味活性物質的OAV分析

序號 化合物 含量/（μg/g） 閾值/（mg/kg）[28]OAV 1 月桂烯 0.017 0.016 6 1.04 2 雙戊烯 0.275 0.004 68.62 3 1-石竹烯 0.257 0.064 4.01 4 桉葉油醇 0.286 0.000 26 1 098.77 5 1-辛烯-3-醇 0.011 0.002 5.36 6 芳樟醇 0.251 0.001 5 167.25 7 糠醇 0.720 0.3 2.40 8 丁香酚 0.413 0.001 413.19 9 辛醛 0.017 0.000 1 65.66 10 壬醛 0.007 0.003 5 23.40 11 十二醛 0.014 0.001 07 12.84 12 檸檬醛 0.017 0.005 3.47 13 對丙烯基茴香醚 1.365 0.1 13.65

如表3所示，在檢測出的48 種揮發性風味物質中，有13 種化合物的OAV大于1，包括3 種烴類物質，4 種醇類物質，1 種酚類物質，4 種醛類物質，1 種醚類物質。它們對五香驢肉的風味有貢獻作用。其中桉葉油醇、丁香酚的OAV大于200，說明它們對五香驢肉的風味有關鍵性貢獻作用。在所有揮發性組分中含量較多的是醇類和醚類物質，在一定程度上說明了揮發性風味物質的質量濃度大小決定了OAV的大小[12]。

OAV大于1的烴類化合物鑒定出3 種，Shahidi等[13]認為無論是飽和烴還是不飽和烴對食品風味形成中發揮的作用均較小。月桂烯具有令人愉快的甜香脂氣味，與驢肉制作過程中添加的花椒等香辛料有關[14]。雙戊烯和1-石竹烯二者分別具有檸檬香味[15]和淡的丁香似香味[16]。雙戊烯含量為0.275 μg/g，1-石竹烯含量為0.257 μg/g，二者含量相近但OAV值差較大，說明揮發性風味物質的OAV不僅與物質含量有關還與閾值有關。

醇類主要來自于脂肪的氧化，不飽和脂肪酸在氧化裂解生成醛的過程中，會生成醇和醛的混合物，不飽和醇的閾值較低，OAV較大，對風味的形成有較大貢獻[17]，本實驗中OAV大于1的醇類物質共鑒定出4 種，其中鑒定出的不飽和醇有1-辛烯-3-醇、芳樟醇、糠醇、其中糠醇含量最高，有特殊的苦辣氣味。1-辛烯-3-醇是亞油酸自動氧化的產物，具有蘑菇風味[18]。芳樟醇具有類似檸檬的香味，天然存在于肉桂揮發性成分中[19]，與驢肉制作過程中添加的肉桂等香辛料有關。

酚類物質僅鑒定出丁香酚。丁香酚是丁香揮發油中最主要的風味成分[20]，具有辛香、煙熏香、熏肉樣香氣和特殊濃烈的味道。

醛類物質主要來源于脂氧化和降解，Strecker降解反應也是其重要來源之一[21]。OAV大于1的醛類鑒定出3 種，雖然含量較低，但閾值也較低，具有脂肪香味，是肉品香味的主要構成部分。其中壬醛具有強烈的脂肪、柑橘香氣和味道[22]。辛醛是驢肉制作過程中添加的姜中的主要成分[23]，未稀釋前具有粗油脂的氣息，稀釋后具有甜橙，輕油脂味，蜂蜜樣香氣[24]。十二醛天然存在于八角蓮葉中[25]，具有強烈脂肪香氣，并有類似松葉油和橙油的強烈香氣。檸檬醛屬于烯醛類化合物，主要提供果香、甜香、脂肪香及陳香[26]。

脂肪氧化的另一產物是酮類，酮類閾值較高，OAV較小，對驢肉的風味貢獻程度相對較小。一般認為酮類物質具有清香氣味、奶油味和果香味。GC-MS檢測出的酮類化合物有4 種，其中3-羥基-2-丁酮含量最高，具有奶油似香氣；甲基庚烯酮具有果香、柑橘香氣。由于酮類化合物閾值較高，實驗中4 種酮類化合物的OAV均小于1，未在表2中列出。

酸類和酯類閾值較高，OAV較小，對驢肉的特征風味貢獻不大。GC-MS鑒定出酸類5 種，其中含量較高的是己酸和辛酸，分別具有強烈的、腐臭奶酪香氣[18]和略有不舒適的氣味和焦膣味。鑒定出的6 種酯類中，δ-十二內酯含量最高，具有甜的水果和芹菜似香氣。它們的OAV均小于1。

醚類化合物的作用在肉制品風味中很重要，本實驗鑒定出對丙烯基茴香醚的OAV大于1且含量較高，其具有茴香、辛香甘草的氣味，天然存在與八角茴香、小茴香精油中[27]。

綜上可知，醇類、酚類、醛類、醚類物質共同構成了五香驢肉獨特的風味。

2.3 五香驢肉風味活性物質的GC-O-MS分析

表4列出了由嗅聞檢測到的21 種風味活性物質，包括烴類2 種、醇類6 種、酚類1 種、醚類1 種、酮類3 種、醛類2 種、酯類2 種、雜環化合物類4 種。但由質譜檢測出的揮發性物質卻有48 種，說明大部分揮發性物質都沒有香氣特征。從嗅聞口聞到的香氣特點包括烤香、堅果香、辛香、油脂味、甜香等。主要香氣特征是辛香、烤香、甜香。由表4的強度數據（強度=3）可知，氣味強烈的有桉葉油醇（涼香，藥草香）、丁香酚（酸甜，辛香）、對丙烯基茴香醚（甜香、清涼、藥草香）、壬醛（油脂味）、2-甲基吡嗪（烤香）、2,6-二甲基吡嗪（堅果香）、2-乙酰基吡咯（烤香、甜香）、麥芽酚（焦糖香）。這些化合物對驢肉風味貢獻最大，是起主要作用的風味成分。桉葉油醇、丁香酚、對丙烯基茴香醚是制作過程中添加的香辛料的揮發性成分[19,29]，主要提供辛香。雜環類化合物主要來自美拉德反應的產物，是肉品中重要的風味呈味物質[30]，主要提供烤香。壬醛提供了脂肪類香氣。

表4 GC-O-MS法鑒定五香驢肉的風味活性物質Table 4 Flavor-active compounds in spiced donkey meat identified by GC-O-MS

對比可知，OAV法和GC-O-MS法2 種方法共同確定的風味活性物質有6 種，包括1-石竹烯、桉葉油醇、芳樟醇、丁香酚、壬醛和對丙烯基茴香醚。說明2 種方法在鑒定五香驢肉風味活性物質方面有一致性。

2 種方法鑒定結果的不同之處在于，OAV小于1的2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、麥芽酚在GC-O-MS中被鑒定為風味活性物質，而被OAV法鑒定為風味活性物質的月桂烯、雙戊烯、1-辛烯-3-醇、糠醇、辛醛卻沒有在GC-O-MS中檢測到。說明2 種方法存在一定的差異性與不足之處[12]。

2.4 感官評定

食品風味是由多種芳香物質共同決定的，芳香物質的檢測結果是對食品揮發性香氣物質實際含量水平的反映，各芳香物質的作用雖然能夠通過閾值與含量計算，但在實際風味中不少芳香物質的作用仍是不確定的。因為不同物質的氣味特征不同。含量高的風味物質不一定有積極作用，也可能會降低整體風味。因此，需要對芳香物質與感官評定建立一種聯系，以便進一步確認風味活性物質，對五香驢肉的感官評定結果，如圖2所示。

由圖2可以看出，五香驢肉的風味輪廓為肉香、辛香、咸香、油脂香、甜香、烤香、清香、果香、酸味、堅果香。其中肉香、辛香、咸香、油脂香、焦甜香、烤香對驢肉的風味具有較大影響。感官評定結果與GC-O-MS結果（主要香氣特征是辛香、烤香、甜香）具有一定相似性，同時也存在差異。出現這一現象的原因是感官評定鑒定的是整體香氣的感官特征，而風味物質以復合體的形式存在時，相互之間會出現相乘、相殺等效應。GC-O-MS得到的是單一物質的香氣特征，并不能體現整體香氣的香氣特征。因此感官評定結果與GC-O-MS結果具有一定的相似性又各具特點。

圖2 五香驢肉的風味剖面圖Fig. 2 Flavor profile of spiced donkey meat

3 結 論

依據OAV和GC-O-MS結果可知，五香驢肉的關鍵性風味物質為桉葉油醇、丁香酚、對丙烯基茴香醚、壬醛、2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯和麥芽酚。它們為真空包裝五香驢肉生產的質量控制、風味評價方面提供了實驗依據。

OAV法和GC-O-MS法在鑒定五香驢肉風味活性物質方面有一致性，OAV法實現了對食物復雜香氣的簡單化分析，GC-O-MS將儀器與感官結合。同時二者也具有差異和不足。在實際工作中既可以根據樣品的性質選擇合適的方法，也可以將2 種方法結合使用。

參考文獻：

[1] 尤娟, 羅永康, 張巖春. 驢肉脂肪和脂肪酸組成特點及與其他畜禽肉的分析比較[J]. 食品科技, 2009, 34(2): 118-120.

[2] HAVEMOSE M S, JUSTESEN P, BREDIE W L P, et al. Measurement of volatile oxidation products from milk using solvent-assisted flavor evaporation and solid phase micro extraction[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(7): 746-752. DOI:10.1016/j.idairyj.2006.09.008.

[3] MURAT C, GOURRAT K, JEROSCH H, et al. Analytical comparison and sensory representativity of SAFE, SPME, and purge and trap extracts of volatile compounds from pea flour[J]. Food Chemistry,2012, 135(3): 913-920. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.06.015.

[4] 段艷, 鄭福平, 楊夢云, 等. ASE-SAFE/GC-MS/GC-O法分析德州扒雞風味化合物[J]. 中國食品學報, 2014, 14(4): 222-230.DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.04.005.

[5] GUADAGNI D G, BUTTERY R G, HARRIS J. Odour intensities of hop oil components[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,1966, 17(3): 142-144. DOI:10.1002/jsfa.2740170311.

[6] ROTHE M, THOMAS B. Aromastoffe des Brotes[J]. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 1963, 119(4): 302-310.

[7] 何聰聰, 蘇柯冉, 劉夢雅, 等. 基于AEDA和OAV值確定西瓜汁香氣活性化合物的比較[J]. 現代食品科技, 2014, 30(7): 279-285.

[8] XIE J C, SUN B G, ZHENG F P, et al. Volatile flavor constituents in roasted pork of Mini-pig[J]. Food Chemistry, 2008, 109(3): 506-514.DOI:10.1016/j.foodchem.2007.12.074.

[9] 常玉梅. 描述性檢驗與消費者接受度感官分析方法研究[D]. 無錫:江南大學, 2013.

[10] 國家標準化管理委員會. 感官分析選拔, 培訓和管理評價員一般導則第二部分 專家評價員: GB/T 162912—2012[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012: 24-25.

[11] 劉笑生, 劉建斌, 劉夢雅, 等. SAFE與SDE法對金華火腿皮下脂肪氣味活性物質研究[J]. 食品科學技術學報, 2014, 32(1): 40-46.DOI:10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.008.

[12] 龐雪莉, 胡小松, 廖小軍, 等. FD-GC-O和OAV方法鑒定哈密瓜香氣活性成分研究[J]. 中國食品學報, 2012, 12(6): 174-182.DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2012.06.026.

[13] SHAHIDI F, RUBIN L J, D’SOUZA L A. Meat flavor volatiles:a review of the composition, techniques of analysis, and sensory evaluation[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1986,24(2): 141-243. DOI:10.1080/10408398609527435.

[14] 張根生, 程健博, 岳曉霞, 等. 花椒對哈爾濱風干腸菌系及其菌系對風味的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(8): 184-190. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708029.

[15] 盧靖, 劉平, 張麗珠, 等. 腐乳發酵過程揮發性風味成分的變化[J].食品科學, 2014, 35(16): 175-179. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201416034.

[16] 程煥, 陳健樂, 林雯雯, 等. SPME-GC/MS聯用測定不同品種楊梅中揮發性成分[J]. 中國食品學報, 2014, 14(9): 263-270.

[17] 夏延斌. 食品風味化學[M]. 北京: 化學工業出版社, 2008.

[18] STARK W, FORSS D A. A compound responsible for mushroom flavor in dairy products[J]. Journal of Dairy Research, 1964, 31(3):253-259. DOI:10.1017/S0022029900018185.

[19] 黃亞非, 黃際薇, 陶玲, 等. 不同樹齡肉桂揮發油的成分比較[J].中山大學學報(自然科學版), 2005, 44(1): 82-85. DOI:10.3321/j.issn:0529-6579.2005.01.021.

[20] 金宏, 公衍玲, 趙文英. 丁香揮發油GC-MS特征指紋圖譜[J]. 青島科技大學學報(自然科學版), 2007, 28(2): 110-112. DOI:10.3969/j.issn.1672-6987.2007.02.005.

[21] 臧明伍, 王宇, 韓凱, 等. 香港醬牛肉揮發性風味化合物的研究[J]. 肉類研究, 2009, 23(6): 46-51. DOI:10.3969/j.issn.1001-8123.2009.06.013.

[22] 孫寶國, 何堅. 香料化學與工藝學[M]. 北京: 化學工業出版社, 2004.[23] 劉源, 徐幸蓮, 周光宏. 頂空固相微萃取氣質聯用檢測生姜揮發性成分[J]. 中國調味品, 2004(1): 42-44.

[24] 李小林, 陳誠, 黃羽佳, 等. 頂空固相微萃取-氣質聯用分析4 種野生食用菌干品的揮發性香氣成分[J]. 食品與發酵工業, 2015, 41(9):174-180. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201509034.

[25] 李錦輝. 貴州產地八角蓮葉揮發性成分分析[J]. 食品科學, 2015,36(12): 138-141. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201512026.

[26] ZHENG X Q, LI Q S, XIANG L P, et al. Recent advances in volatiles of teas[J]. Molecules, 2015, 21(3): 338. DOI:0.3390/molecules21030338.

[27] 林翔云. 香精香料辭典[M]. 北京: 化學工業出版社, 2007: 166.

[28] 里奧·范海默特. 化合物香味閾值匯編[M]. 北京: 科學出版社, 2015.

[29] 王琴, 蔣林, 溫其標, 等. 氣質聯用對不同提取法的八角茴香油化學成分的分析[J]. 食品工業科技, 2006, 27(10): 189-190. DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2006.10.062.

[30] 李建軍, 文杰, 陳繼蘭, 等. 烘烤雞肉揮發性風味物的微捕集和GC-MS分析[J]. 分析測試學報, 2003, 22(1): 58-61. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2003.01.018.