高效液相色譜-串聯三重四極桿飛行時間質譜法鑒別五味子中木脂素成分

丁 博，陳文銳，王志元，謝建軍，曾廣豐，王 璐，佘志剛

五味子是傳統中醫藥材原料，最早記載于東漢的《神農本草經》，具有悠久的食用歷史；因為其有咸、甘、酸、辛、苦等味道，被成為五味子[1]。中國傳統文化提倡藥食同源，很多中藥材都被作為膳食功能補品供人們食用，比如人參、靈芝等藥材在一定食用量條件下，作為食品被人們食用。五味子主要化學成分為木脂素、揮發油、有機酸、維生素、萜類、多糖類等化學成分，其中木脂素類化合物主要生物藥理活性成分，包括有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等[2]。我國學者研究表明，五味子木脂素類化合物具有護肝作用、抗氧化性、增強免疫力、抗疲勞等作用[3-5]。因此，許多保健食品用五味子作為功能作用原料，通過檢測保健食品中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲3 個化合物的含量，評估保健食品中五味子功效作用。

目前五味子木脂素類化合物檢測方法主要高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質譜聯用兩種方法。張延妮等[6]利用反相-HPLC方法，采用紫外檢測器檢測南五味子中五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素；竇志華[7]、趙玥[8]等用HPLC測定五味子種子及果皮中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6 種含量，結果顯示木脂素主要存在于種子中。胡俊揚[9]與沈曉君[10]等利用HPLC測定不同產地五味子中8 種木脂素成分，不同產地五味子中五味子醇甲為主要成分。有學者[11-13]提出中藥有效成分的內在函數關系與比例關系，提出“一測多評”方法利用HPLC測定五味子醇甲成分評估其他4、6 種或8 種木脂素成分，并與外標法對比表明“一測多評”方法誤差符合要求。譚春梅等[14]利用HPLC分析五味子和南五味子中指紋圖譜，以木脂素指紋圖譜分析評價五味子產品的質量。李曉亮等[15]利用HPLC測定五味子和南五味子中木脂素成分的指紋圖譜，其中南五味子藥材指紋圖譜中標定25 個共有峰，顯示不同產地五味子木脂素成分差異顯著。高文新[16]采用超高效液相色譜聯用高分辨質譜分析五味子提取物的木脂素成分，利用木脂素成分質譜行為差異，分別對南五味子和北五味子的木脂素成分進行比較分析。王寶蓮等[17]應用HPLC聯用紫外/質譜方法建立五味子醇提物的化學、體外代謝、體內藥代和藥效指紋圖譜。由此可見，五味子中木脂素化合物主要為液相色譜檢測方法，復雜樣品基質嚴重干擾木脂素化合物的色譜分離、鑒定，需要研究開發質譜尤其是高分辨質譜法檢測五味子中木脂素類化合物，以此評估不同地區五味子的產品質量。

2003年國際分析化學年會上，一種新的檢測蔬菜與水果農藥殘留的分析法被科研工作人員提出，并命名為QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法，該方法操作原理是樣品依次加入乙腈與水體積比為70∶30作提取劑，硫酸鎂和氯化鈉（質量比4∶1）為有機相與水相分散劑，C18、石墨化碳、陰陽離子交換劑等雜質吸附劑，均質、攪拌與離心，從而提取純化樣品，進行儀器檢測分析[18]。目前，廣泛應用于蔬菜和水果農藥殘留檢測領域[19-20]。近年來也有文獻報道將QuEChERS法類比用于其他天然有機物提取前處理領域，比如大豆異黃酮類樣品[21-23]。本研究利用HPLC-串聯三重四極桿飛行時間質譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）技術結合QuEChERS前處理方法分析五味子中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的含量，同時通過數據依存獲取高分辨質譜（information dependent acquisition-mass spectrometry，IDA-MS）技術評估南北五味子質量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子樣品購于百姓中藥批發公司、東北長白山特色食品公司（淘寶網）。

3 種五味子標準品：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲 德國Dr Ehrestorfer公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國賽默飛世爾科技公司；甲酸（色譜純） 上海阿拉丁試劑公司；硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉（均為分析純） 廣州化學試劑廠；吸附劑C18填料（100～200 目） 德國CNW公司；石墨化碳吸附劑填料 美國西格瑪試劑公司；所有用水均為純水機制備的超純水（電導率18.2MΩ·cm）。

分別配制五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲3 種五味子質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，根據需要配制成系列質量濃度的混合標準工作溶液。

1.2 儀器與設備

Triple TOFR5600＋高分辨質譜儀 美國ABsciex公司；HPLC 20AD HPLC儀 日本島津公司；Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm） 美國Waters公司；Turbo Vap?LV氮吹濃縮儀 瑞典Biotage公司；T25高速均質機、VORTEX 4旋渦混勻器 德國IKA公司；4k-15離心機 美國Sigma公司；Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進樣體積：5 μL；流速：0.5 mL/min； 柱溫：40 ℃；梯度洗脫：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫條件：初始30% B相5 min升至80%，1 min升至100%，保留1 min，0.5 min降至30%，保留2.5 min。

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離和大氣壓化學電離復合源；正離子掃描方式；大氣壓化學離子源連接動校正系統，每10 個樣品自動校正1 次，大氣壓化學離子源利血平混合液正離子校正液流速0.3 mL/min，氣簾氣壓力：40 psi，霧化氣壓力：50 psi，輔助氣壓力：50 psi，離子源溫度：500 ℃，離子源電壓：5 500 V。一級TOF-MS掃描準確質量范圍：100～1 000 Da，數據采集時間100 ms， 去簇電壓：100 V，碰撞電壓：10 V；二級IDA-MS掃描準確質量范圍：50～1 000 Da，去簇電壓：100 V，碰撞電壓：（35±15）V；高靈敏模式，數據采集時間50 ms，信號閾值100 cps，IDA實驗每循環采集6 次數據，動態背景減法扣除。

1.3.3 樣品前處理

準確稱量1.000 g五味子原料，加入20 mL的70%乙腈溶液，1.0 g硫酸鎂和0.25 g氯化鈉，80 mg C18吸附劑，振蕩1 min，超聲振蕩15 min，渦旋、離心，轉移上清液至25 mL刻度管，加入純凈水定容，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，稀釋10 倍或100 倍上機測試。

1.4 數據分析

高分辨質譜數據在ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，質譜數據在PeakView 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件上定性定量處理分析。

2 結果與分析

2.1 五味子定性、定量分析依據

本研究選擇五味子中木脂類化合物五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素目標分析對照參考物質。首先將3 個目標化合物進行HPLC-Q-TOF-MS分析，獲得目標化合物高分辨質譜數據信息；根據一級TOF-MS和二級IDA-MS信息，結合HPLC留時間定性定量分析目標化合物。3 個五味子木脂素類化合物的定性定量分析質譜數據依據見表1。根據目標化合物的準確分子離子峰、同位素峰、準確二級碎片峰以及液相保留時間，可以進行檢測分析五味子樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量。

表1 3 種五味子木脂素化合物高分辨質譜數據Table 1 Mass spectral data of individual lignanoids analyzed by IDA-MS

2.2 定量分析校準曲線、檢測限與定量限測定結果

樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，根據目標化合物的一級TOF-MS高分辨質譜信息進行分析。首先利用HPLC-Q-TOF-MS分析方法獲得目標化合物的離子流色譜（圖1），3 種目標化合物配制成混合標準溶液，稀釋成一系列質量濃度，獲得目標化合物的校正曲線，以及線性范圍；同時以3 倍信噪比和10 倍信噪比依據，確定方法的檢測限與定量限（表2）。結果表明，校準曲線的R2在0.999 6以上，檢測限為0.3～1.5 μg/L，定量限為1～5 μg/L。

圖1 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of three lignanoid standards

表2 五味子木脂素類校準曲線、檢測限與定量限Table 2 Calibration curves, coefficients of determination, LODs and LOQs for lignanoids

2.3 五味子前處理方法的優化

采用QuEChERS前處理方法提取樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素。分別選擇硫酸鎂與氯化鈉（方案1），硫酸鎂、氯化鈉與檸檬酸鈉（方案2），硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑（方案3），硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉與C18吸附劑（方案4）4 種方案優化五味子木脂素類化合物的提取條件，結果見圖2。

圖2 不同萃取條件下五味子木脂素化合物的含量Fig. 2 Lignanoids contents determined using different extraction conditions

圖2 顯示：4 種前處理萃取條件差異不顯著，方案3硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑提取樣品時，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量較好。為此，以下實驗均選擇硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑的QuEChERS前處理方法提取五味子樣品中五味子木脂素類化合物。

2.4 回收率實驗結果

為了進一步驗證QuEChERS前處理方法與HPLC-Q-TOF-MS檢測五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量分析方法，實驗選擇100 μg/L和200 μg/L兩個水平（表3）。結果顯示，加標回收率在110.6%～115.3%之間，表明本方法可以用于五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的檢測。

表3 回收率實驗結果Table 3 Recoveries of deoschisandrin, schisandrin and schisandrin B from spiked sample

2.5 實際樣品測定結果

5 個樣品的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的測定結果見表4。結果顯示北五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量比較高，分別在1.72～2.22 mg/g和1.00～1.31 mg/g之間，而南五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量在0.2 mg/g以下。南五味子中五味子甲素含量在2.88～3.76 mg/g之間，北五味子含量在0.7 mg/g以下。結果表明南北五味子中木脂素類化合物含量存在顯著差異。

表4 實際樣品測定結果Table 4 Lignanoids contents of commercial samples

2.6 五味子木脂素化合物的鑒定

表5 五味子木脂素類化合物XIClist[24-30]Table 5 XIClists of lignanoids in S. chinensis

續表5

五味子木脂素類化合物是五味子主要生物活性化合物，為了進一步分析抽查的5 個南北五味子樣品的木脂素類化合物的分布情況，研究查閱整理國內外文獻報道從五味子植物提取分離到木脂素類化合物[24-30]，建立高分辨質譜XIClist列表（表5），在PeakView軟件根據木脂素類化合物的分子結構式與IDA-MS信息，進行結構與質譜數據匹配度分析，在非標準品條件下鑒定樣品中木脂素類化合物的分布情況。

圖3 樣1 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 1

由圖3可知，樣1分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C23H30O6的木脂素化合物為戈米辛K1、K2與K3；分子式為C28H36O8木脂素化合物為巴豆酰戈米辛H和當歸酰戈米辛H。

圖4 樣2 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 2

由圖4可知，樣2分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C23H30O6的木脂素化合物是戈米辛K1、K2與K3；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H和當歸酰戈米辛H。

圖5 樣3 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 3

由圖5可知，樣3分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C28H34O9的木脂素化合物是巴豆酰戈米辛P和當歸酰戈米辛P；分子式為C23H38O7木脂素化合物是戈米辛A。

圖6 樣4 IDA-MS質譜篩查離子流色譜圖Fig. 6 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 4

由圖6可知，樣4分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式為C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分異構的木脂素類化合物，分子式為C28H34O9的木脂素化合物為巴豆酰戈米辛P和當歸酰戈米辛P以及其他同分異構體化合物；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H與當歸酰戈米辛H兩個化合物其中一個。

圖7 樣5 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 7 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 5

由圖7可知，樣5分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式為C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分異構的木脂素類化合物，分子式為C28H34O9的木脂素化合物為巴豆酰戈米辛P和當歸酰戈米辛P以及其他同分異構體化合物；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H與當歸酰戈米辛H兩個化合物其中一個。

對比分析圖3～7發現，3 個北五味子中樣1和樣2離子流指紋色譜圖相似，樣3北五味子的木脂素成分與樣1和樣2存在一定差異性；樣4與樣5兩個南五味子的離子流指紋色譜圖相似。綜上所述可以通過IDA-MS篩查保健食品中功效成分的特征化合物的差異，判斷保健食品產品的質量優劣。

2.7 方法對比優勢

早期文獻報道[14-15]五味子HPLC-質譜圖譜鑒定分析評估五味子產品的品質，需要標準品或對照品，以及液相色譜分離條件，進行樣品的鑒定分析，本實驗研究開發QuEChERS結合HPLC-Q-TOF-MS檢測五味子中木脂素化合物的分析方法，可以在非標準品或對照品，以及復雜樣品基質條件下，通過提過提取木脂素類化合物的高分辨質譜離子流色譜圖，利用49 種木脂素化合物結構式與IDA-MS的匹配關系，鑒定樣品中木脂素成分。準確快速地篩查鑒定樣品中木脂素化合物及其產地來源。

3 結 論

以五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3 個五味子木脂素化合物為目標物，優化QuEChERS前處理技術提取五味子中木脂素最佳萃取凈化條件，開發了HPLC-Q-TOF-MS檢測五味子中木脂素的分析方法。與HPLC及液相色譜-質譜等分析方法相比，該方法在液相色譜分離度低、復雜樣品基質以及無標準品條件下，可根據一級TOF-MS和二級IDA-MS信息，實現五味子中木脂素化合物的分析與鑒定；同時根據IDA-MS信息鑒別樣品中木脂素化合物分布情況，從而鑒定五味子產品的品質。由此可見，QuEChERS與HPLC-Q-TOF-MS分析方法快速篩查五味子中木脂素成分的選擇性好、靈敏度高、準確性高；將該方法用于5 個五味子樣品的鑒定，明顯篩查鑒別出南五味子與北五味子的差異。

參考文獻：

[1] 王越. 五味子化學成分的研究[D]. 長春: 吉林大學, 2015: 1-10.

[2] 王慧清. 南北五味子化學成分研究[D]. 大連: 遼寧師范大學, 2009:1-5.

[3] 高雁, 李廷利. 五味子有效成分的藥理作用研究進展[J]. 中醫藥學報, 2011(6): 104-106.

[4] 王寶蓮, 扈金萍, 盛莉, 等. 五味子醇提物的化學-藥代-藥效指紋圖譜研究(英文)[J]. 藥學學報, 2013(5): 734-740. DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.05.010.

[5] 皮子鳳, 侯廣月, 艾軍, 等. 化學計量學方法研究北五味子中木脂素含量與抗氧化活性的相關性[J]. 中國中藥雜志, 2012(8): 1133-1139.DOI:10.4268/cjcmm20120817.

[6] 張延妮, 岳宣峰, 王喆之. 反相高效液相色譜同時測定五味子中五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的含量[J]. 分析科學學報,2007(1): 41-44.

[7] 竇志華, 安莉萍, 張琳, 等. HPLC測定五味子種子及果皮中的6 種木脂素類成分[J]. 華西藥學雜志, 2016, 31(2): 205-207. DOI:10.13375/j.cnki.wcjps.2016.02.031.

[8] 趙玥, 王冰, 孟雪君. 五味子不同部位5 種木脂素成分含量測定[J].遼寧中醫藥大學學報, 2010, 12(11): 222-223.

[9] 胡俊揚, 陸兔林, 毛春芹, 等. HPLC法同時測定不同產地五味子中8種木脂素類成分[J]. 中成藥, 2012, 34(2): 313-316.

[10] 沈曉君, 劉玉翠, 曲曉波, 等. HPLC法同時測定不同產地五味子中4種木脂素類成分的含量[J]. 中國藥房, 2017, 27(3): 387-390.

[11] 賀鳳成, 李守信, 趙志全, 等. 一測多評法測定五味子中4 種木脂素類成分的含量[J]. 藥學學報, 2012, 47(7): 930-933.

[12] 竇志華, 安莉萍, 陳敏, 等. 一測多評法測定五味子中6 種木脂素類成分的含量[J]. 中國藥學雜志, 2014, 49(2): 147-151.

[13] 王麗君, 劉淑敏, 毛春芹, 等. 一測多評法同時測定五味子中6 種木脂素類成分的含量[J]. 藥物分析雜志, 2015, 35(7): 1191-1197.

[14] 譚春梅, 黃琴偉, 張文婷, 等. 五味子和南五味子的HPLC指紋圖譜研究[J]. 中國現代應用藥學, 2008(6): 514-517. DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2008.06.005.

[15] 李曉亮, 易進海, 劉云華, 等. 南五味子、五味子HPLC指紋圖譜研究和木脂素成分測定[J]. 中成藥, 2011, 33(6): 920-924.

[16] 高文新. 五味子木脂素類成分HPLC、UPLC/Q-TOF-MS分析[D].哈爾濱: 黑龍江中醫藥大學, 2012: 43-53.

[17] 王寶蓮, 扈金萍, 盛莉, 等. 五味子醇提物的化學-藥代-藥效指紋圖譜研究[J]. 藥學學報, 2013, 48(5): 734-740.

[18] ANASTASSIADES M, LEHOTAY S J, ?TAJNBAHER D, et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International, 2003, 86(2): 412-431.

[19] WILKOWSKA A, BIZIUK M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology[J]. Food Chemistry,2011, 125(3): 803-812. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.09.094.

[20] NIELL S, JESúS F, PéREZ C, et al. QuEChERS adaptability for the analysis of pesticide residues in beehive products seeking the development of an agroecosystem sustainability monitor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(18): 4484-4492.DOI:10.1021/acs.jafc.5b00795.

[21] DELGADO-ZAMARRE?O M M, PéREZ-MARTíN L,BUSTAMANTE-RANGEL M, et al. A modified QuEChERS method as sample treatment before the determination of isoflavones in foods by ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 100: 320-328. DOI:10.1016/j.talanta.2012.07070.

[22] BUSTAMANTE-RANGEL M, DELGADO-ZAMARRE?O M M,PéREZ-MARTíN L, et al. QuEChERS method for the extraction of isoflavones from soy-based foods before determination by capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry[J].Microchemical Journal, 2013, 108: 203-209. DOI:10.1016/j.microc.2012.10.023.

[23] BUSTAMANTE-RANGEL M, PéREZ-MARTíN L, DELGADOZAMARRE?O M M. Comparative study of the methodology used in the extraction of isoflavones from legumes applying a modified QuEChERS approach[J]. Phytochemical Analysis, 2014, 25(2): 170-177. DOI:10.1002/pca.2487.

[24] HE X G, LIAN L Z, LIN L Z. Analysis of lignan constituents from Schisandra chinensis by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 757(1): 81-87.DOI:10.1016/S0021-9673(96)00685-1.

[25] HANCKE J L, BURGOS R A, AHUMADA F. Schisandra chinensis(Turcz.) Baill[J]. Fitoterapia, 1999, 70(5): 451-471. DOI:10.1016/S0367-326X(99)00102-1.

[26] AVULA B, CHOI Y W, SRINIVAS P V, et al. Quantitative determination of lignan constituents from Schisandra chinensis by liquid chromatography[J]. Chromatographia, 2005, 61(9): 515-518.

[27] HUANG X, SONG F, LIU Z, et al. Studies on lignan constituents from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fruits using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization multiple-stage tandem mass spectrometry[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2007, 42(9):1148-1161. DOI:10.1002/jms.1246.

[28] SOVOVá H, OPLETAL L, BáRTLOVá M, et al. Supercritical fluid extraction of lignans and cinnamic acid from Schisandra chinensis[J].The Journal of Supercritical Fluids, 2007, 42(1): 88-95. DOI:10.1016/j.supflu.2007.01.008.

[29] PANOSSIAN A, WIKMAN G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of russian research and uses in medicine[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 118(2): 183-212.

[30] LU Y, CHEN D F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11): 1980-1990.DOI:10.1016/j.chroma.2008.09.070.