石墨烯電化學傳感器法快速測定植物油中的苯并（a）芘

馮亞凈，李書國*

苯并（a）芘（benzo(a)pyrene，BaP）是由5 個苯環構成的稠環化合物，具有較強的致癌性、致畸性、致突變性[1-2]，是世界衛生組織確定的三大致癌物質之一，其普遍存在于環境與食品中，可通過皮膚、呼吸、飲食等多種途徑進入人體[3-4]。在一些植物油的制備過程中會產生大量的BaP[5-8]，對此，各國對植物油中BaP含量進行了嚴格的控制，其中歐盟較為嚴格，規定植物油中BaP的最大限量為2 μg/kg；國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）規定食用油脂中BaP的最大限量為5 μg/kg；而我國食用植物油衛生標準規定最大限量為10 μg/kg，相對較為寬松[9-10]。因此，建立一種簡便、快速、準確的BaP檢測方法成為研究的重點。

目前，檢測BaP的方法主要有熒光分析法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質譜聯用法及酶聯免疫吸附法[11-22]等，前3 種方法雖穩定性好、靈敏度高，但樣品處理繁瑣、儀器成本高、消耗時間長；酶聯免疫吸附法雖簡單快速但其靈敏度較低。而電化學方法具有操作簡單、成本低、速度快、靈敏度高等特點，受到了廣大研究人員的青睞，成為食品安全快速檢測技術方法的主流之一[23-25]。Du Chunyuan等[26]采用微分脈沖伏安法，研究了在乙腈-水溶液中BaP在裸玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上的氧化還原性質，建立了一種用于實際水樣中BaP檢測的電化學分析方法，檢測限為0.67 nmol/L。Keskin等[27]采用方波溶出伏安法進行測定，發現在醋酸緩沖液中BaP在石墨電極上出現了一個明確的伏安響應，檢測限為0.002 7 μmol/L。Yardim等[28]采用吸附溶出伏安法，研究了在添加表面活性劑的水溶液中BaP在摻硼金剛石電極上的電化學氧化性質，檢測限為2.8 nmol/L。但目前研究BaP在修飾電極上的氧化還原特性的還很少。

本實驗采用新型材料石墨烯（graphene，GS）和殼聚糖（chitosan，CS）構建電化學納米傳感器，研究了BaP在修飾電極表面的氧化還原性質，建立了一種快速檢測植物油中痕量BaP的納米傳感器方法，并將其應用在實際樣品中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小磨香油 石家莊市購。

BaP（96%，CAS：50-32-8） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GS 北京德科島金科技有限公司；乙腈（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；正己烷（分析純） 天津市津東天正精細化學試劑廠；甲醇（色譜純） 天津市康科德科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LK98BII型微機電化學分析系統 天津蘭力科化學電子高技術有限公司；三電極系統、電解杯 上海CHI儀器公司；LC-10A型HPLC儀 日本島津公司；FA 2204型電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；KQ 2200型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS-1型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；TGL-16C型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；GZX-9070 MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；85-2型控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CS-GS修飾液的制備

取0.02 g CS加入到100 mL體積分數1%的乙酸溶液中，持續攪拌至無氣泡，得到透明的CS溶液，于4 ℃條件下貯存。取0.01 g GS加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺，超聲處理20 min，制得均勻分散的GS懸浮液。取5 mL GS懸浮液加入到5 mL CS溶液中，超聲處理30 min，使GS均勻地分散在CS溶液中，得到CS-GS修飾液，于4 ℃貯存備用。

1.3.2 電化學傳感器的制備

先將GCE用Al2O3粉末（粒徑 0.05 μm）打磨拋光，至電極表面成鏡面，再依次于體積分數為50%的硝酸溶液、無水乙醇和去離子水中各超聲處理3 min，然后在1 mol/L H2SO4溶液中采用快速循環伏安法（電位：－0.5～0.8 V；掃描速率：500 mV/s）掃描至穩定的循環伏安圖，從而對GCE進行活化，最后用N2吹干，備用。

取上述修飾液5 μL滴涂到已經過預處理的GCE表面，在紅外線燈下烘干，備用。

1.3.3 電化學傳感器測定BaP

電化學分析法的測定均采用三電極系統：Φ 3 mm經修飾的玻碳圓盤電極為工作電極、Ag/AgCl為參比電極、鉑絲電極為輔助電極，并采用線性掃描伏安法進行測定，掃描電位為0.5～1.3 V，掃描速率為30 mV/s。

電化學檢測包含兩部分：第1部分是BaP在電極表面的富集，將CS-GS/GCE在開路狀態下浸沒在含有BaP的乙腈-水（1∶3，V/V）溶液中，并用磁力攪拌器不斷攪拌；第2部分是BaP的測定，將富集了BaP的CS-GS/GCE轉移到乙腈-水的空白溶液（0.2 mol/L的LiClO4溶液作為電解質，0.1 mol/L的硫酸溶液調節pH值）中，采用循環伏安法與線性掃描伏安法進行測定，測定3 次，并記錄相應的峰電流值，并取其平均值作為該BaP濃度所對應的氧化電流值Ip。

1.3.4 植物油樣品中BaP的測定

1.3.4.1 樣品預處理

稱取（1.0±0.05）g香油，然后加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，超聲處理30 min后移至分液漏斗中，取30 mL正己烷飽和乙腈萃取3 次，合并下層乙腈層后，用旋轉蒸發儀蒸發至干，接著用乙腈分3 次淋洗旋蒸瓶并定容至1 mL。樣品提取液以5 000 r/min離心10 min后經0.45 μm濾膜過濾后進行檢測。

1.3.4.2 電化學傳感器法測定

按照1.3.3節的方法進行測定，將3 次測定結果的平均值帶入標準曲線中得到樣品中BaP含量。

1.3.4.3 HPLC法測定

色譜條件[29-30]：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（90∶10，V/V）；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為20 μL；激發波長為384 nm，發射波長為406 nm。

準確稱取25.0 mg BaP標準品于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，保存于4 ℃條件下備用。配制梯度濃度為10、20、50、100、200、500、1 000 nmol/L的標準溶液，取20 μL標準溶液進樣，記錄其HPLC圖譜，根據所得峰面積與對應的BaP濃度繪制標準曲線。取上述處理好的樣品提取液20 μL，進行HPLC檢測，取3 次峰面積的平均值作為該樣品的圖譜峰面積，代入標準曲線計算樣品中BaP濃度，并與電化學檢測方法的結果進行對比。

1.4 數據處理與統計分析

以上測定均為3 組平行實驗，結果取3 組實驗數據的平均值。運用SPSS 18.0軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析進行顯著性差異分析（P＜0.05），實驗數據圖利用 OriginLab Origin Pro v9.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 BaP在不同修飾電極表面的氧化還原行為

采用快速循環伏安法，研究BaP在裸GCE（a）、CS/GCE（b）、GS/GCE（c）、CS-GS/GCE（d、e）上的氧化還原行為，結果見圖1。BaP在各GCE上均出現了一個明顯的氧化峰，電位也均在1.0 V附近，而沒有出現還原峰，說明該反應是不可逆的；修飾了CS后，其氧化峰電流比裸GCE減小了17.37%，這是由于CS在GCE表面形成了一層膜，阻礙了電子之間的傳遞；而修飾了GS后，峰電流明顯增大，增大了3.85 倍，這是由于GS具有相當大的比表面積以及突出的電學性質，為電子與電極之間的電子傳遞提供了一個微通道；當修飾了CS-GS后，峰電流進一步增大，增大了4.71 倍，這可能是由于CS極好的成膜性將更多的GS固定在GCE的表面。所以CS-GS/GCE具有良好的電化學性質。根據圖1d、e比較，可以看出BaP的氧化響應電流隨著BaP濃度的增大而增大。

圖1 不同電極的循環伏安圖Fig. 1 Cyclic voltammograms of different electrodes

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 修飾液配比與修飾量

修飾液的配比與修飾量對納米傳感器的電子傳遞具有重大的影響。配制CS溶液與GS懸浮液體積比為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1的修飾液，取5 μL修飾經處理的GCE，采用線性掃描伏安法測定BaP的氧化電流，結果如圖2A所示。當CS溶液與GS懸浮液體積比為1∶2時，峰電流達到最大值，之后在一定范圍內隨著CS的增加峰電流逐漸減小，這是由于CS的成膜性質會阻礙電子傳遞的結果。所以選擇修飾液的配比為1∶2。分別將1、3、5、7、9 μL的CS-GS修飾液滴涂到GCE上，采用線性掃描伏安法測定其電流的大小，結果如圖2B所示。隨著修飾量的增加，峰電流逐漸增加，當修飾量為5 μL時，峰電流達到最大，然后隨著修飾量的增大，峰電流逐漸減小，這是因為修飾膜太厚影響電子傳遞的結果。

圖2 修飾液配比（A）和修飾量（B）對電化學傳感器電流的影響Fig. 2 Effects of composition and volume of modified solution on response current of electrochemical sensor

2.2.2 電解質濃度

采用線性掃描伏安法，研究BaP在不同LiClO4濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L）的底液條件下的氧化響應電流的變化，結果如圖3所示，一開始，峰電流隨著電解質濃度的增大而顯著增大，當LiClO4濃度為0.2 mol/L時，氧化峰電流值達到最大，LiClO4的濃度繼續增大，其峰電流的變化趨向平穩，說明電子之間的傳遞達到了平衡，導電率達到了最大。所以選擇電解質濃度為0.2 mol/L。

圖3 電解質濃度對電化學傳感器電流的影響Fig. 3 Effect of electrolyte concentration on response current of electrochemical sensor

2.2.3 硫酸濃度

硫酸濃度與BaP在溶液中的穩定性有著直接的聯系，對峰電流也有顯著影響。在保證其他實驗條件一致的情況下，只改變底液中硫酸濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L），采用線性掃描伏安法進行BaP的測定，結果如圖4所示。BaP的響應電流先隨著硫酸濃度的增加而增大，這是由于硫酸可提供質子以促進BaP發生氧化反應；當硫酸濃度為0.1 mol/L時，峰電流的值達到最大，繼續添加硫酸，其對峰電流的影響不大，說明此時BaP發生氧化反應所需要的質子的量已達到最大，所以選取硫酸濃度為0.1 mol/L。

圖4 硫酸濃度對電化學傳感器電流的影響Fig. 4 Effect of sulfuric acid concentration on response current of electrochemical sensor

2.2.4 富集時間

富集時間與電極表面吸附BaP的多少有關，影響著電化學傳感器測定的準確性。配制相同BaP濃度的溶液，富集時間分別為5、10、15、20、25 min，在相同的底液中采用線性掃描伏安法進行測定，如圖5所示。在5～15 min范圍內峰電流隨著富集時間的延長而增大，當富集時間達到15 min后，峰電流的變化較小，說明BaP在電極表面的富集達到了飽和狀態。實驗選擇富集時間為15 min。

圖5 富集時間對電化學傳感器電流的影響Fig. 5 Effect of enrichment time on response current of electrochemical sensor

2.3 電化學測定BaP的分析性能

分別配制0、20、40、60、80、100、200、400 nmol/L的BaP標準溶液，按照1.3.4節進行測定，每個濃度均測定3 次，取其平均值為該濃度的響應電流值，不同濃度BaP的線性掃描曲線，如圖6所示。BaP的氧化反應電流Ip值隨BaP濃度的增大而增大，且在BaP濃度范圍為0～100 nmol/L時Ip值與CBaP之間的關系滿足線性關系方程：Ip= 0.116 2CBaP＋22.926 2，線性相關系數R2=0.997 8，其檢測限為0.103 nmol/L（RSN=3）。可見，本實驗構建的電化學傳感器具有較好的靈敏度，可作為一種快速測定BaP的分析方法。

圖6 不同濃度BaP的線性掃描曲線Fig. 6 Linear sweeping curves of BaP at different concentrations

2.4 電化學傳感器的抗干擾性、穩定性和重復性

考察與BaP性質相同的脂溶性抗氧化劑（VE、TBHQ和PG）對BaP氧化響應電流的影響。分別配制0.1 mol/L的VE、TBHQ和PG溶液，溶劑為乙醇，在4 ℃條件下保存備用。在其他條件相同的情況下，采用線性掃描伏安法分別測定空白的VE、TBHQ和PG溶液、空白的BaP標準溶液以及分別添加3 種抗氧化劑的BaP標準溶液的電化學氧化響應電流，結果如表1所示。該電化學傳感器對3 種脂溶性抗氧化劑均可吸附，但其峰位置均在0.35～0.65之間，而BaP的峰位置在1.03左右，互相不影響；且在分別添加VE、TBHQ和PG后，BaP的氧化響應電流變化僅為6.15%、4.72%、4.07%。說明該電化學傳感器的抗干擾性較好。

表1 電化學傳感器抗干擾性測定結果Table 1 Interference resistance of electrochemical sensor

分別制備3 批電化學傳感器（每批3 支），第1批當天進行測定；第2批3 d后進行測定；第3批7 d后進行測定；結果表明，在相同條件下測定同一樣品，同一批次的變化率均在3.41%以下，不同批次的變化率不超過6.77%，說明該電化學傳感器的穩定性和重復性較好。

2.5 香油樣品中BaP的測定

按照1.3.4.1節處理樣品，得到樣品提取液，分別采用納米電化學傳感器法和HPLC法檢測樣品中BaP的含量，并進行加標回收實驗，按照1.3.5節計算其平均值和相對標準偏差，結果如表2所示，本法測得樣品中BaP含量為22.96 nmol/L，而HPLC法測得23.04 nmol/L，二者相差僅0.35%；在分別加有5、10、20 nmol/L的BaP標準品后，本法的回收率在98.51%～100.57%之間，HPLC法則在98.22%～100.58%；另外，兩種方法的相對標準偏差均在2.15%～3.16%之間。所以二者基本一致，電化學傳感器法快捷方便。

表2 香油樣品中BaP回收率測定的結果Table 2 Recovery of BaP from spiked sesame oil

測得市售香油中BaP的含量約為5.76 μg/kg，在我國限量標準（10 μg/kg）之內，但超過了歐盟標準（2 μg/kg）與CAC規定的限量（5 μg/kg）。

3 結 論

BaP具有致癌、致畸、致突變的性質，對身體的危害極大，快速簡便的檢測方法是及時減小其危害的基本前提。本實驗用具有極好成膜性的CS與大比表面積的納米粒子GS修飾GCE，優化了GCE的導電性能，基于BaP的電化學氧化還原性質，構建了一種速率快、穩定性強、靈敏度高的電化學傳感器，并應用于實際樣品中BaP的測定。采用循環伏安法與線性掃描伏安法測定BaP的氧化還原電流，發現該反應為不可逆反應，其氧化電流與BaP濃度在0～100 nmol/L范圍內呈線性關系。本實驗還對其修飾測定條件進行了優化，確定了數學模型、線性范圍、檢測限等參數，實現了BaP的快速、準確、現場檢測。此外，該傳感器制作簡單、穩定好、重復性好，檢測過程抗干擾性強、檢測時間短，在食品中BaP快速檢測中的開發前景廣闊。

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