基于紅外光譜指紋和揮發性組分信息融合模型鑒別大米產地來源

杜夢佳，毛 波，沈 飛，李 彭，裴 斐，胡秋輝，方 勇,*

水稻是世界上主要的糧食作物之一，大米品質容易受到原料品種和產地環境如土壤、水等因素影響[1]。目前市場上一些不法商家受利益驅使，用一些低檔、劣質稻米冒充地理標志大米，以假亂真，嚴重侵犯了消費者利益，甚至危及生命安全[2-3]。目前常用的大米產地鑒別技術主要有傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）技術、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術等。FTIR技術可反映含氫基團振動引起的倍頻和合頻吸收峰信息[4-5]。當生長環境變化時，大米中成分組成或結構可能發生改變，導致不同基團或同一基團在不同環境中產生的近紅外光譜在吸收峰的位置和強度上有所不同，利用這種差異可以反映大米產品的地域特征[6-8]。Lin等[9]采集了3 種不同品種超級水稻的光譜指紋信息，結合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）建立了產地鑒別模型，總體鑒別率可達90%。GC-MS是一種用于檢測揮發組分的有效方法，由于產地環境對大米中有機揮發性組分的積累有較大影響，使得利用GC-MS技術進行產地鑒別成為可能[10-12]。Lim等[13]利用GC-MS采集朝鮮和中國大米樣品的揮發性組分指紋信息，結合PLS-DA建立了產地鑒別模型，具有一定的鑒別效果。還有研究者采用固相微萃取-質譜技術研究不同程度香氣大米樣品的揮發性組分指紋信息，并結合類比獨立分類法（soft independent modeling of class analogies，SIMCA）進行了分類[14]。

上述大米產地判別方法多是基于單一鑒別指標如光譜指紋信息或揮發性組分指紋信息，尤其是由于大米中的揮發性組分指紋信息的不穩定性，導致單一指標鑒別結果的準確性和可靠性較差。隨著食品鑒別檢測技術的逐漸成熟，目前，國內學者應用信息融合技術檢測食品品質的研究已有較多報道。Sun Wenjuan等[15]采用近紅外光譜融合中紅外光譜建立鑒別正品和贗品大黃的模型，結合SIMCA，支持向量機、人工神經網絡、PLS-DA等分析顯著提高了鑒別準確率。陶思嘉等[16]通過融合不同品種葡萄酒的近紅外和中紅外光譜指紋信息，結合貝葉斯和PLS-DA分析，融合信息后的鑒別準確率優于單獨采用一種光譜技術的鑒別結果。雖有研究將不同指紋信息融合起來進行鑒別，但這些指標為同種屬性的指紋信息，同樣難以保證鑒別結果的客觀性和準確性。而且根據查閱文獻可知，融合不同屬性指紋信息進行大米產地鑒別的方法鮮見報道。

因此，為建立一種紅外光譜指紋信息和揮發性組分信息融合鑒別模型，提高模型對大米產地的鑒別率。本研究以盤錦、射陽和五常大米3 種典型地理標志大米為鑒別對象，篩選3 個產地大米樣品中具有顯著性差異的揮發性組分和光譜吸光度為特征鑒別指標，利用PLS-DA建立融合信息模型，并且與單一指標模型的鑒別效果進行比較，以期為全面客觀、準確可靠鑒別地理標志大米提供技術理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地理標志大米樣品分別采自中國的江蘇省射陽縣、黑龍江省五常市和遼寧省盤錦市，其中采自江蘇省射陽縣的大米共19 個樣品，分別采自海河鎮、臨海鎮、合興鄉、射陽縣、淮海農場、耦耕鎮；采自黑龍江省五常市的大米樣品共15 個樣品，分別采自五常市、安家鎮、民樂鄉、民意鄉、二河鄉、志廣鄉、常卜鄉；采自遼寧省盤錦市的大米樣品共20 個樣品，采自大洼縣；大米樣品均采自2015年秋季的當地農田，每個采樣點采集2 kg樣品，采用二分法選擇500 g作為分析試樣。

2,4,6-三甲基吡啶、甲醇（均為優級純） 阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型GC-MS聯用儀 美國安捷倫公司；手動固相微萃取裝置（50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷纖維頭） 美國Supelco公司；CH-9230型恒溫水浴鍋 瑞士步琪公司；TP-214型電子分析天平北京丹佛儀器有限公司；Tensor27型傅里葉紅外光譜分析儀 德國Bruker公司；101-3AS型電熱鼓風干燥箱上海蘇進儀器設備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

分析試樣處理按照GB/T 1354—2009《大米》粳米一級加工標準進行加工。

大米粉碎處理：用研磨粉碎機分別對精米樣品磨粉30 s，為了獲得均勻顆粒，粉碎的樣品均通過80 目篩子篩選，粉碎好的樣品分裝在潔凈的樣品袋中，密封，置于溫度20 ℃，含水量為14%的干燥器中，備用。

1.3.2 FTIR光譜采集[17]

利用Tensor 27型FTIR和45 ℃ ZnSe衰減全反射附件掃描大米樣品的光譜指紋信息。采用固體壓片法取約0.50 g樣品置于直徑為13 mm的ZnSe晶體上，鋪布均勻，加壓至0.8 GPa，保持1 min，光譜區域設定為0～4 500 cm－1，分辨率為8 cm－1，掃描次數為32 次，以空氣為背景，室溫條件下測定，采集紅外光譜，取每個產地大米樣品的平均光譜作為該產地的最終紅外譜圖，每做完一個樣品采用酒精棉球擦拭樣品槽。

1.3.3 GC-MS檢測[18]

稱取6.00 g大米顆粒（距樣品封存1 周）置于頂空樣品瓶中，加入1 μL內標物質（1 μL 2,4,6-三甲基吡啶用甲醇定容在5 mL的容量瓶），密封后置于預先設好的恒溫（80 ℃）水浴鍋中平衡50 min，再將萃取頭插入頂空瓶吸附60 min，于GC-MS進樣口解吸5 min。每個樣品進行3 次重復。

GC-MS檢測參數：HP-5MS毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：從柱初溫50 ℃升至125 ℃，速率為8 ℃/min，保持3 min，然后升至165 ℃，速率為4 ℃/min，保持3 min，最后升至230 ℃，速率為10 ℃/min，保持2 min，后運行為2 min。第1次使用萃取針時，萃取頭需要在GC進樣口（氮氣保護條件下）老化2 h，老化溫度為270 ℃。在以后的使用過程中，使用前需要在以上溫度條件下老化20 min，脫去萃取頭上的雜質。載氣N2；載氣流速1.0 mL/min；AUX-2溫度280 ℃；電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；采集模式全掃描。

1.3.4 信息融合[19]

將已獲得的共54 份大米樣品的特征光譜范圍吸光度和特征揮發性組分含量作為自變量，產地分類作為因變量，其中提取的每個樣品的特征光譜范圍中每個波數點對應的吸光度為一個變量，即將數據列為n×p數據矩陣X和n×q數據矩陣Y，n為樣本數，p為自變量，q為分類變量，取2/3的樣品作為建模集，1/3的樣品作為驗證集，建模集用于構建指紋因子-大米產地模型，驗證集用于對構建的模型進行驗證、評價，利用Matlab 8.0軟件對建模樣本的自變量矩陣X和分類變量Y建立模型，判斷樣品所屬類別。

為了評價上述基于融合信息建立的PLS-DA模型的適用性與合理性，采用相同方法獲得了基于單一指紋信息建立的鑒別模型，即大米產地與大米揮發性組分因子、大米產地與大米光譜指紋因子模型，對這3 種模型進行對比分析。

1.4 數據處理

采用數據處理軟件SPSS 16.0進行ANOVA分析，Matlab 8.0軟件進行PLS-DA分析。PLS-DA是一種基于PLSR的多變量統計分析方法，它是對原始矩陣（揮發性組分指紋信息或光譜指紋信息）X和類別變量Y之間的關系進行計算，得到X與Y的最大協方差，通常設定模糊變量的臨界值（±0.5）來判定樣品的分類歸屬，利用留一交叉驗證法獲得PLS-DA模型的最優潛變量數（LV），評估模型的鑒別精密度[20]。GC-MS實驗數據由計算機檢索并與圖譜庫（NIST 08）的標準質譜圖對照進行分析，再結合相關文獻進行人工譜圖解析，根據大米樣品的GC-MS指紋圖譜、離子峰的保留時間和峰面積找到共有峰，確認大米樣品中揮發性組分的化學結構和名稱，其相對含量采用峰面積歸一化法分析。

2 結果與分析

2.1 特征光譜指紋信息的提取

圖1 盤錦、射陽和五常大米樣品的FTIR平均光譜圖Fig. 1 FTIR average spectra of rice samples from Panjin,Sheyang and Wuchang

如圖1a所示，3 種大米的光譜圖整體趨勢一致，表明它們的化學成分比較相似。而在特定波數范圍內（960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1），3 種大米的光譜信息存在差異，如圖1b～d所示，在這3 組波數范圍內，射陽大米光譜吸光度均明顯高于盤錦和五常大米，這與其生長環境如土壤、水源等密切相關，有可能是射陽獨特的環境氣候，水稻生長早期積溫偏低，使得營養生長期相對較長，在作物成熟期，積溫較高，光照充足等原因，更利于干物質積累和沉淀，加上射陽土壤富鉀的特性，更利于大米中多糖的形成[21-23]。其中在960～1 060 cm－1范圍內的光譜峰為多糖的特征吸收區，在994 cm－1附近的強吸收峰與多糖的C—O的伸縮振動相關[24-25]。在1 601～1 685 cm－1光譜范圍內的吸收峰為酰胺化合物的特征吸收區，在1 643 cm－1附近的吸收峰與—CONH中C—O伸縮振動及有機羧酸鹽COO—的不對稱振動相關[24,26]。3 000～3 620 cm－1范圍為亞甲基（—CH2）、甲基（—CH3）、羥基（—OH）和氨基（—NH）的振動吸收峰，在3 286 cm－1附近強而寬的吸收峰，是核苷酸、氨基酸的N—H伸縮振動和羥基O—H伸縮振動的疊加，這部分的吸收主要反映出大米中核酸、蛋白質、脂肪酸和碳水化合物（纖維素、多糖）等對光譜的貢獻[27]。因此，選取光譜范圍在960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1之間的光譜指紋信息做進一步的產地鑒別。

2.2 特征揮發性組分指紋信息的提取

表1 盤錦、射陽和五常大米樣品中共有揮發性組分的GC-MS結果Table 1 GC-MS analysis of common volatile compounds in rice samples from Panjin, Sheyang and Wuchang

利用GC-MS對20 份盤錦、19 份射陽和15 份五常大米中的揮發性組分進行分析檢測，這3 種大米中分別檢測出127、137 種和119 種化合物。在此基礎上，找到在相同保留時間條件下，3 個產地的大米樣品中共同存在的揮發性組分，通過篩選，獲得共有揮發性組分13 種，如表1所示。盤錦大米中反-2-壬烯醛、壬醇、萘、（＋）-長葉烯和十六烷的相對含量最高。射陽大米中的2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、萘、癸醛和十四烷的相對含量最低。在五常大米中，2-戊基呋喃、壬醛和十二烷的相對含量最高，（＋）-長葉烯和十五烷的相對含量最低。此外，在13 種共有揮發性組分中，苯甲醛、2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、壬醇、萘、癸醛、十四烷、（＋）-長葉烯和十五烷這10 種化合物的相對含量因產地不同而具有顯著性差異（P＜0.05）。因此選取這10 種物質作為特征揮發性組分指紋信息建立鑒別模型。

2.3 PLS-DA信息融合

圖2 基于大米樣品特征揮發性組分模型（A）、特征光譜模型（B）和融合信息模型（C）PLS-DA的得分圖Fig. 2 PLS-DA score plots of characteristic volatile model (A),characteristic spectral model (B), and information fusion model (C) for rice samples

表2 利用PLS-DA建立3 種鑒別模型的分析結果Table 2 Analysis of three discriminant models established by PLS-DA%

FTIR反映的是化學有機組分中官能團的種類與含量，GC-MS具有定量檢測揮發性組分的特征，但是大米樣品中的有機化學組分很大程度上受到其生長環境的影響，僅基于該單一指標鑒別不具有全面性和客觀性，而揮發性組分的不穩定性，在單一指標鑒別中準確率較低，且可靠性較差，因此，紅外光譜和揮發性組分信息融合是多源信息融合，不同維度數據提供的信息具有更強的多樣性[28-29]?；诓煌b別因子指紋信息建立的PLS-DA模型的前2 個因子得分如圖2所示，由圖2A、B可知，不同產地大米樣品的分布具有顯著性重疊，其中在圖2A中，盤錦大米、射陽大米和五常大米的分布均有交互重疊，在圖2B中，盤錦大米、射陽大米與五常大米的分布具有明顯的重疊，而盤錦大米與射陽大米的分布基本沒有重疊。在圖2C中，3 個產地的大米樣品的分布區分較為明顯，相互之間基本沒有重疊。此外，從圖2A到圖2C可以看出，不同產地樣品分布重疊的顯著性依次降低，表明基于信息融合建立的PLS-DA模型鑒別大米產地具有一定的可行性。

提取的特征光譜吸光度（范圍為960～1 060、1 601～1 685 cm－1和3 000～3 620 cm－1）和10 種特征揮發性組分含量（苯甲醛、2-戊基呋喃、壬醛、反-2-壬烯醛、壬醇、萘、癸醛、十四烷、（＋）-長葉烯和十五烷）作為自變量，3 個產地分類作為因變量，導入Matlab統計分析軟件，結合PLS-DA法建立融合信息-大米產地的鑒別模型，并與單一指紋信息建立模型的鑒別效果進行比較分析，如表2所示，驗證集的靈敏性由91.4%（紅外光譜模型）和84.8%（揮發性組分模型）變為融合后的97.4%，特異性由92.1%（紅外光譜模型）和82.4%（揮發性組分模型）變為融合后的97.0%，表明信息融合模型的鑒別靈敏度和精確度相比于單一指標模型（紅外光譜模型和揮發性組分模型）有所提高。在單一指紋信息鑒別模型中，揮發性組分模型的靈敏性為84.8%，表明15.2%的樣品被判為其他類，但其特異性僅為82.4%，說明鑒別精確度不足，這有可能與樣品經過脫殼等處理，其揮發性組分信息受到嚴重干擾，導致樣品誤判率較高[14]。在這3 種鑒別模型中，揮發性組分模型、紅外光譜模型和信息融合模型的驗證集準確率分別為88.9%、92.9%和97.4%。相比于揮發性組分模型和紅外光譜模型，信息融合模型的準確率分別提高了8.5%和4.5%，這是因為融合的光譜指紋信息和揮發性組分指紋信息反映了可能的相互作用和協同效應[30]。因此，信息融合技術較大的提高了模型的鑒別效果。

3 結 論

大米樣品的紅外光譜主要體現的是有機組分中分子基頻振動的信息，GC-MS體現的是揮發性組分信息，二者信息來源不同且屬性不同，PLS-DA信息融合充分利用了這2 種信息，實現了信息互補。本方法可以通過修正部分單獨鑒別時混淆或者錯判的樣品，得出正確結果，從而提高鑒別準確率和可信度，使得信息融合處理后模型的鑒別準確率提高。

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