TGF-β1介導人乳牙牙髓干細胞分化為血管平滑肌細胞的研究

胡露露，艾 琦，胡曉燕，楊 梓，王銀龍，沈 軍

目前，體外構建人工血管的主要策略是利用提取的原代血管構成細胞，如人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和功能性血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，vSMCs)重新構建血管。然而，較難的原代細胞分離技術、有限的原代細胞增殖能力，以及人體組織來源的稀缺性，嚴重阻礙了原代細胞的實際運用。因此，誘導干細胞成為內皮細胞或血管平滑肌細胞成為解決該問題的主要思路。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)目前較廣泛地用于誘導干細胞分化成平滑肌細胞[1]。研究[2]表明，TGF- Smads信號通路對于誘導多能干細胞分化成平滑肌細胞起到關鍵作用。 TGF-β1既可單獨也可以聯合其他因子共同誘導干細胞分化為平滑肌細胞，例如TGF-β1和骨形態發生蛋白4可以誘導脂肪干細胞分化為平滑肌細胞，TGF-β1聯合血小板衍生因子BB可以誘導人胚胎干細胞分化平滑肌細胞。因此，該研究的目的是采用TGF-β1生長因子誘導人乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)分化為vSMCs，并探索分化的可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞提取及培養收集脫落的乳牙，無菌下提取牙髓組織，剪碎后放入I型膠原酶和中性蛋白酶混合液中消化1 h，然后使用孔徑為70 μm的細胞篩進行過濾，488 r/min離心5 min，完成后用常規DMEM培養基(含10%FBS和1%P/S)重懸并轉入T25細胞培養瓶，37 ℃、5%CO2培養箱常規培養，每3 d換液一次，待生長到70%時消化轉入到T75細胞培養瓶，擴大培養后用于后續實驗。在SHED進行vSMCs誘導前，對其“多能性”進行評估，使用流式細胞儀檢測SHED的干細胞標志物(CD45、CD90、CD105、CD73)表達情況，并做成脂、成神經和成骨等多向分化能力的鑒定。原代HUVECs和vSMCs購自美國ScienCell公司，并用相應的培養基培養(平滑肌細胞培養基和內皮細胞培養基均購自美國ScienCell公司)，作為陽性對照。

1.2誘導SHED分化為vSMCs取第4～6代SHED，按照3×103cells/cm2接種，常規DMEM培養基培養，待細胞貼壁后，換成vSMCs誘導培養基(5% FBS DMEM+不同濃度2.5、5、10、20、30 ng/ml TGF-β1)，獲得誘導后不同時間點SHED-vSMCs。

1.3RT-qPCR按照RNA提取試劑盒說明，提取細胞樣本的總RNA，取1 μg的總RNA，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明，轉成20 μl cDNA，并同樣按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明，完成PCR反應。本實驗所用引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游下物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′; α-SMA上游引物：5′-CCGACCGAATGCAGAAGGA-3′,下游引物：5′-ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3′; SM22α上游引物：5′-AGTGCAGTCCAAAATCGAGAAG-3′,下游引物：5′-CTTGCTCAGAATCACGCCAT-3′;Calponin上游引物；5′-GTCAACCCAAAATTGGCACCA-3′,下游引物：5′-ACCTTGTTTCCTTTCGTCTTCG-3′。

1.4Westernblot用RIPA裂解液冰上裂解樣本20 min，后高速離心15 min，收集上清液并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測量樣本的蛋白濃度，然后根據測量得到的蛋白濃度，計算20 μg樣本蛋白所需的劑量，進行Western blot實驗。本實驗所用抗體如下：鼠單克隆抗β-actin抗體(編號：sc-47778)購自美國Santa Cruz公司;兔多克隆抗SM22 alpha抗體 (編號：ab14106)、兔抗Calponin抗體 (編號：ab46794)購自英國Abcam公司。

1.5免疫熒光在誘導前將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中進行誘導，完成誘導后用冰PBS洗2次，然后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，然后用0.5%的Triton-100通透細胞5 min，PBS洗3次，每次5 min；使用2%BSA封閉細胞1 h，然后根據具體的蛋白孵不同的一抗，4 ℃房過夜，PBS洗3次，每次5 min后孵二抗1 h，PBS洗3次，每次5 min；封片后熒光顯微鏡檢查目的蛋白。本實驗所用抗體如下：α-SMA (編號：A2547)購自德國Sigma-Aldrich公司；SM22 alpha (編號：ab14106)、SMMHC (編號：ab683)、Calponin (編號：ab46794)為一抗，羊抗鼠Alexa Fluor 488(編號：ab150117)和羊抗兔Alexa Fluor 488(編號：ab150077)為二抗，均購自英國Abcam公司。

1.6體外Matrigel血管生成實驗為了研究SHED誘導分化的vSMCs是否可以促進血管結構的穩定性，本研究使用體外Matrigel血管生成實驗，評估SHED-vSMCs在維持血管結構穩定性中的作用。將5×105～8×105個細胞接種到T25培養瓶，以便細胞24 h后達到80%融合；并將Matrigel從-70 ℃冰箱移放到4 ℃冰箱，同時將48孔板和1 ml槍頭置于4 ℃冰箱；第2天在冰上用預冷的1 ml槍頭將Matrigel轉入預冷的48孔板(120～200 μl每孔)，迅速置于37 ℃培養箱30 min；常規消化細胞，按照5 ∶1比例將HUVECs和SHED-vSMCs用內皮細胞培養基重懸成濃度為3.2×105cells/ml的單細胞懸液，然后取100 μl該單細胞懸液輕輕滴在已經凝固的Matrigel表面，并繼續37 ℃培養箱常規培養；于不同時間點在顯微鏡下觀察小管形成情況并隨機選擇5個視野拍照記錄，然后用Image J 軟件進行分析。

2 結果

2.1酶消化法提取的SHED具有多能干性如圖1所示，流式細胞儀結果顯示SHED表達干細胞標志物CD105，CD90以及CD73，不表達CD45。圖2進一步顯示了SHED具有成骨、成神經以及成脂能力。

2.2TGF-β1可誘導SHED分化為vSMCs如圖3A所示，誘導7 d后，TGF-β1上調了vSMCs特異性標志物(α-SMA、SM22α和Calponin)的mRNA表達水平，不同濃度(10、20、30 ng/ml)之間結果差異無統計學意義。因此，在進一步研究中僅使用10 ng/ml TGF-β1的劑量。

為了獲得最佳的誘導時間，本研究評估不同時間點(第3、5、7天以及第1、2代)10 ng/ml TGF-β1的誘導效果。如圖3B、C所示，vSMCs表型標志物的表達在第5天達到最高水平，第7天略有下降，誘導效果能維持到第1和第2代。免疫熒光結果(圖4)進一步表明了誘導后的SHED表達vSMCs標志物。

為了評估SHED誘導為vSMCs的分化效率，通過流式細胞術來分析α-SMA、SM22α、Calponin和SM-MHC陽性細胞的百分比。結果如圖5所示，這些標志物具有較高的表達(α-SMA86.1%，SM22α 93.9%，Calponin 56.8%，SM-MHC 88.2%)。

圖1 細胞流式儀結果A：CD105 ；B：CD90 ；C：CD73；D：CD45

圖2 SHED具有成骨、成神經及成脂能力A：SHED成骨誘導，茜素紅染色；B：SHED成神經誘導×4；C：SHED成脂誘導，油紅o染色×4

圖3vSMCs特異標志物在基因水平和蛋白水平上的表達

A:不同濃度TGF-β1誘導下α-SMA、SM22α和Calponin的mRNA表達水平；B、C:10 ng/ml TGF-β1在不同時間點的誘導效果；1：對照組；2：2.5 ng/ml；3：5 ng/ml；4：10 ng/ml；5：20 ng/ml；6：30 ng/ml；7：第3天；8：第5天；9：第7天；10：第1代；11：第2代；12：原始vSMCs

圖4 免疫熒光下vSMCs標志物的表達 免疫熒光染色×20

圖5 SHED誘導vSMCs具有較高的誘導效率

2.3SHED誘導分化的vSMCs表現出與原代vSMCs相似的功能特性Matrigel血管形成實驗結果表明，誘導SHED分化的vSMCs具有與原代vSMCs相類似的功能。如圖6A所示，SHED誘導分化的vSMCs緊密附著在HUVEC形成的三維血管結構的表面，并顯著增加了血管結構的存活時間(圖6B)。

3 討論

血管化組織工程復合體的構建是制約組織工程技術在臨床上有效應用的關鍵問題。如何讓體外構建的組織器官快速獲得血供，從而保證其早期存活以及功能維持，是組織工程學研究的一個熱點和難點。目前，最有效的策略是在體外構建組織器官過程中同時進行預血管化[3]。預血管化組織工程復合體可以迅速與受體形成血管吻合，從而快速建立血液循環，確保構建組織器官內部的營養供應以及代謝物質的排除。預血管化的方案主要是將血管組成細胞，包括血管內皮細胞和血管壁細胞(血管周平滑肌細胞vSMCs以及周細胞Pericytes)，植入人工支架，通過細胞在支架內的增殖以及分化，最終形成類似機體的血管樣結構[4]。因此，用于構建血管的種子細胞特性及組織來源對預血管化起到決定性作用。受體自身血管組織被認為是最合適的細胞來源，然而由于提取困難、細胞數量不足及增殖率低等因素，目前無法在實驗及臨床中進行廣泛應用。干細胞具有多向分化潛能、增殖速度快、來源廣泛等優勢，利用干細胞作為種子細胞運用于組織工程具有誘人的臨床應用前景。

目前，在組織工程預血管化研究中，研究較多的有胚胎干細胞和誘導多能干細胞。有胚胎干細胞和誘導多能干細胞是一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細胞，能夠被誘導為幾乎機體所有類型的細胞。然而，獲取有胚胎干細胞所產生的倫理問題和使用過程中存在的免疫排斥反應，以及生成誘導多能干細胞的過程中可能會出現的危險變異從而導致產生一些未知的疾病，使得利用有胚胎干細胞/誘導多能干細胞作為種子細胞處于嚴重窘境。

最近研究[5]表明，成體干細胞(骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞以及血管內皮前體細胞)同樣具有定向分化為vSMCs的潛能，然而，獲取這些成體干細胞需要較為繁瑣的手術過程，以及常規誘導方法血管內皮細胞誘導效率過于低下等問題，限制了其將來的臨床應用前景。相對于上述成體干細胞，SHED具有以下優勢：① SHED來源于自然脫落的乳牙，不會對供者產生任何額外的損害；② 由于是自身來源，從而也避免了免疫排斥反應；③ 除了表達早期間充質干細胞標志物STRO-1和CD146等，SHED亦表達胚胎干細胞的標志物Oct4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4[6]，并具有多向分化能力，如可以分化為成骨/成牙本質細胞，脂肪細胞，神經細胞。另外，SHED最近還被證實能夠分化為內皮細胞[7]，然而，尚未有SHED分化為vSMCs的報道。在本研究中使用生長因子TGF-β1誘導SHED，結果表明SHED可以分化為功能性的vSMCs。

圖6 Matrigel血管生成實驗結果 免疫熒光染色×10

本研究采用α-SMA、SM22α、Calponin，SM-MHC作為鑒定vSMCs的表型標志物，其中SM-MHC只在可收縮性的vSMCs中表達，結果表明，SHED在生長因子TGF-β1刺激下，表達這些vSMCs標志物。成熟vSMCs同時還需具有相應功能，例如穩定血管的能力，促進血管形成能力，以及收縮功能。為了評價SHED來源的vSMCs的血管穩定能力，本研究進行了Matrigel血管生成實驗，將HUVECs與SHED誘導分化來源的vSMCs在Matrigel上進行共培養，HUVECs在Matrigel上能夠形成血管狀結構，SHED-vSMCs能夠穩定HUVECs形成的血管結構，證明了SHED來源的vSMCs具有相應的功能。

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