基于GEO數據庫研究缺氧肺癌中GBE1的表達和意義

丁 翔，葛圣林，張朝東

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均位居全球癌癥首位[1]。最新研究[2]顯示，2015年我國因肺癌死亡61萬例，占所有癌癥死亡人數的21.7%，死亡率居我國各種癌癥死亡率之首。非小細胞肺癌(normal small cell carcinoma,NSCLC)是肺癌最常見的類型，約占肺癌總數的87%。研究[3]顯示，腫瘤微環境對腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力及新生血管的形成有重要影響，是腫瘤不斷惡化并發生轉移的重要原因。而缺氧在細胞增殖、血管生成、免疫監控、新陳代謝，以及腫瘤的侵襲轉移中發揮著重要作用[4]。腫瘤細胞在應對缺氧微環境時，能夠上調葡萄糖轉運蛋白和糖酵解相關酶的表達。葡萄糖是腫瘤無氧酵解主要的能量供給物質，在細胞中能夠以糖原的形式儲存，儲存糖原是腫瘤細胞在應對缺氧和營養不足時的能量來源和生存保障。有研究[5]表明，低氧刺激能夠提高腫瘤細胞中糖原水平，并誘導糖原代謝相關酶的轉錄表達。低氧引發的糖原合成升高，與糖原合成相關酶的表達水平升高相關，包括 UGP2、GYS1、GBE1、PGM 和 PPP1R3C。

糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)是一種葡萄糖基轉移酶，屬α-淀粉酶家族成員。在糖原合成的過程中，能夠催化水解α-1，4-糖苷鍵，將直鏈糖轉化成分支糖[6]。有報道[7-8]稱GBE1 在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤中的表達水平不同，可能與腫瘤的發生發展密切相關。但GBE1在肺癌中的作用尚未有報道。因此，該研究以GEO數據庫為基礎，首次探討GBE1在肺癌缺氧狀態下抑制細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1試劑人非小細胞肺癌細胞A549細胞購自中國科學院上海細胞庫；Lipo2000、青霉素-鏈霉素溶液、PVDF膜和預染蛋白Marker購自美國Life technology公司；30% 甲叉雙丙烯酰胺溶液購自南京厚百公司；ECL發光液購自美國Millipore公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、細胞裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；GBE1 siRNA(貨號：sc-78413)及對照siNC購自美國Santa Cruz公司；GBE1質粒和對照質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；β-actin (貨號：ab8226)和GBE1(貨號：ab180596)抗體購自美國Abcam公司；cleaved-caspase-3(貨號：#9664)、bax(貨號：#2774)和 bcl-2(貨號：#4223)抗體購自美國CST公司；Real-time PCR引物由南京金斯瑞公司設計合成；逆轉錄試劑盒(貨號：RR047A)與SYBR(貨號：RR430A)購自大連TaKaRa有限公司。

1.2儀器全自動酶標儀(美國Bio Rad公司)；三氣培養箱(型號3131，美國Thermo公司)；Step one Plus Real-time PCR擴增儀(美國Life technology公司)；Tanon 5200 全自動化學發光圖像分析系統(上海天能公司)。

1.3方法

1.3.1基于GEO肺癌芯片數據的生物信息學分析 在基因表達匯編(gene expression omnibus,GEO)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載肺癌基因芯片數據。每個數據集均需符合以下條件:① 數據集來自全基因組RNA表達芯片；② 實驗使用人類缺氧肺癌者組織與常氧肺癌組織對照。經過篩選，下載基因表達譜公共數據集GSE30979[9]中10例缺氧組織和10例常氧組織。將這兩組芯片數據導入GCBI(https://www.gcbi.com.cn)在線平臺進行差異基因分析，并對差異基因進行Gene ontology功能富集分析(GO分析)，最后基于KEGG數據庫進行信號通路富集分析。

1.3.2細胞常氧和低氧培養 細胞常氧培養的條件：A549細胞用含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基，置于 37 ℃、5% CO2的條件下培養。細胞低氧培養的條件：培養液同常氧培養的細胞，置于37 ℃、O2體積分數為1%、CO2體積分數為5%和N2體積分數為94%的三氣培養箱中培養24 h[10]。6孔板每孔轉染50 pmol siRNA，96孔板每孔轉染5 pmol siRNA。將siRNA與Lipofectamine 2000混合加入無血清DMEM培養基中，混勻后室溫靜置5 min，加入培養板中繼續培養24 h后進行缺氧處理。A549細胞以5×105個/ml的密度接種于6孔板中，轉染siGBE1或高表達GBE1的質粒24 h后，缺氧處理24 h，Western blot檢測細胞GBE1、cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白表達水平，real-time PCR法檢測細胞GBE1、bcl-2和bax mRNA水平。

1.3.3MTT 法檢測 GBE1對A549缺氧后細胞活力的影響 將A549懸液調整為1×105/ml，接種于96孔培養板，每孔200 μl，分別用Lipofectamine 2000轉染空白質粒和GBE1質粒，每組6個復孔，48 h后各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續培養4 h后，棄去培養基，每孔加入200 μl DMSO，測定在570 nm下的吸光度。

1.3.4Real-time PCR A549細胞接種于6孔板中，加入TRIzol提取RNA，根據試劑盒反應體系逆轉錄合成cDNA，進行Real-time PCR檢測。以GAPDH為內參計算mRNA相對表達量，各指標的PCR引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物：5′- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′； GBE1上游引物：5′- GGAGATCGACCCGTACTTGAA-3′，下游引物：5′- ACATCTGTGGACGCCAAATGA-3′；bcl-2上游引物：5′- GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物：5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；bax上游引物：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游引物：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′；按以下條件進行PCR擴增反應：擴增曲線的反應條件為95 ℃、5 min 1個循環，95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，共40個循環；熔解曲線的反應條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，之后用2-ΔΔCt法定量分析目的基因表達情況。

1.3.5Western blot 檢測caspase-3、bax和 bcl-2 蛋白表達 取對數生長期的細胞，以1 × 105個/ml接種在6孔培養板內，待細胞生長至融合度為70%時轉染siNC和siGBE1，缺氧處理24 h后每孔用100 μl RIPA裂解細胞，12 000 r/min離心后取上清液。BCA 法測量樣品中總蛋白濃度。取蛋白樣品(30 μg/孔)加入10%聚丙烯酰胺凝膠，經電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入一抗(cleaved-caspase-3、bax和bcl-2按1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入相應二抗(1 ∶5 000稀釋)，常溫孵育 1 h，最后加 ECL 發光液，用天能5200曝光儀拍照。

2 結果

2.1差異基因GCBI平臺對上傳的原始芯片數據，首先進行芯片信號值的預處理與預過濾，然后使用差異分析方法，對2組基因芯片數據進行差異基因的篩選。差異基因的篩選條件為：Q值<0.05，得到206個差異基因，其中上調的基因82，下調的基因124。本研究選取差異最大的20個基因進行排序并聚類分析。基因表達譜的聚類結果見圖1，GBE1在缺氧肺癌組織中的表達水平較常氧組織相比升高2.32倍，是兩組基因芯片差異最大的基因。

2.2GO富集分析將206個差異基因用DAVID軟件進行GO富集分析(FDR<0.01)，結果顯示這些基因富集在細胞周期、細胞增殖等生物學進程和核分裂調控等分子功能上。GO富集排名前20的結果見表1。由表1可知，肺癌組織缺氧可能會影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程(GO:0005975)和小分子代謝過程(GO:0044281)。

表1 GO富集分析結果

圖1 差異基因的聚類圖

注：紅色代表相對較高的表達，綠色代表相對較低的表達，黑色代表沒有變化，每一列代表一個樣本，每一行代表一個基因

2.3KEGG通路分析將206個差異基因進行KEGG通路分析，結果顯示這些基因顯著富集于內質網蛋白加工信號通路、HIF-1信號通路、細胞周期、細胞代謝等30個有統計學意義的相關通路(P<0.05)，Pathway分析排名前10的通路見表2。

表2 KEGG通路分析結果

2.4GBE1對A549缺氧后的細胞活力的影響與常氧組相比，缺氧可以分別增加A549細胞GBE1蛋白和mRNA水平(2.67±0.28)倍(P=0.0091)和(2.45±0.31)倍(P=0.008 5)；轉染siGBE1后，A549細胞GBE1的蛋白和mRNA水平分別降低(0.52±0.09)倍(P=0.007 8)和(0.45±0.07)倍(P=0.008 3)倍；轉染GBE1高表達質粒后，A549細胞GBE1的蛋白和mRNA的表達水平分別升高(3.39±0.54)倍(P=0.000 3)和(5.53±0.64)倍(P=0.000 6)，見圖2A、2B。

缺氧24 h后，MTT法檢測細胞增殖活性。結果顯示，與正常組相比，缺氧組A549細胞活力降低至(0.41±0.06)倍(P=0.006 2)，轉染siGBE1后A549細胞活力進一步降低至(0.23±0.04)倍(P=0.032 1)，而高表達GBE1可以升高缺氧造成的細胞活力至(0.89±0.12)倍(P=0.007 7)，見圖2C。

圖2 GBE1對A549缺氧后的細胞活力的影響

A：Western blot檢測A549細胞GBE1蛋白的表達水平；B：Real-time PCR檢測A549細胞GBE1 mRNA水平；C：MTT法檢測A549細胞活力；1：常氧對照組；2：缺氧組；3：siGBE1+缺氧組；4：GBE1+缺氧組：與常氧對照組比較：**P<0.01；與缺氧組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5GBE1對A549細胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達的影響與常氧組相比，缺氧能夠顯著增強cleaved-caspase-3和bax蛋白表達水平(5.48±0.43)倍(P=0.000 2)和(4.29±0.37)倍(P=0.000 9)，降低bcl-2表達至(0.21±0.06)倍(P=0.008 1)。敲降GBE1能夠進一步上調cleaved-caspase-3和bax表達(6.98±0.67)倍(P=0.001 3)和(6.72±0.90)倍(P=0.008 3)倍，降低bcl-2表達至(0.13±0.02)倍(P=0.012 9)，促進細胞凋亡。而高表達GBE1可以降低cleaved-caspase-3和bax表達水平分別至(1.48±0.23)倍(P=0.001 2)和(2.78±0.36)倍(P=0.001 2)，升高bcl-2蛋白和mRNA表達水平至(0.88±0.06)倍(P=0.002 5)和(0.78±0.11) 倍(P=0.002 3)，逆轉缺氧造成的細胞凋亡。見圖3。

圖3 GBE1對A549細胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達的影響

A： Western blot檢測A549細胞cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白的表達水平；B：Real-time PCR檢測A549細胞bax和bcl-2 mRNA水平；1:常氧對照組；2:缺氧組；3:siGBE1+缺氧組；4:GBE1+缺氧組;與常氧對照組比較：*P<0.05，**P<0.01;與缺氧組比較：#P<0.05

3 討論

近年來，隨著我國環境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的發病率和死亡率居高不下。這一方面是由于腫瘤侵襲轉移、易感人群遺傳基因異常等引起，另一些方面是由于肺癌細胞產生多藥耐藥、侵襲轉移的分子機制不明[11]。因此，深入研究肺癌細胞的生物學行為及其分子機制，可以更加準確的評估患者的預后，并找出新的藥物治療靶點。本研究通過分析GEO數據庫和GCBI分析平臺首次發現，GBE1在缺氧肺癌組織中異常高表達，可能與肺癌的缺氧耐受和代謝異常相關。為進一步揭示GBE1在肺癌缺氧耐受中作用機制，筆者分別向A549細胞轉染siRNA和GBE1的質粒，在缺氧條件下檢測A549細胞的活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關基因和蛋白的表達水平，探討GBE1在缺氧肺癌中的意義。

隨著生物信息學的發展，基因芯片作為一種高效、大規模獲取生物信息的技術得到越來越廣泛的應用。GEO數據庫是由美國國家生物技術中心(national center of Biotechnology Information,NCBI)開發的用于存儲和查詢基因芯片數據的綜合性數據庫，為全世界生物工作者進行數據挖掘提供了良好的平臺[12]。本研究顯示，在缺氧肺癌組織中GBE1異常高表達，這可能與肺癌的缺氧耐受有關；對差異基因進行GO分析和信號通路富集分析，發現肺癌組織缺氧可能會影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程和小分子代謝過程，而這些差異基因顯著富集于細胞代謝等信號通路。這些結果同樣證實，GBE1在肺癌缺氧耐受中具有十分重要的作用。

糖原分支的形成一方面增加了糖原水溶性，有利于其貯存，另一方面可為糖原結合蛋白提供對接位點[13]。糖原不僅能夠在無氧的條件下快速代謝為ATP，為腫瘤細胞應對營養和氧氣匱乏時提供能量支持，維持細胞的生存，而且在蛋白翻譯后的修飾、生物合成以及抗氧化保護過程中發揮重要作用[14]。但是GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用卻鮮有報道。

本研究分別向A549細胞轉染siGBE1和GBE1高表達質粒，缺氧處理24 h后，檢測GBE1的蛋白和mRNA表達水平，發現缺氧能夠增加A549細胞GBE1蛋白和mRNA的表達。通過MTT法檢測細胞活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關cleaved-caspase-3、bcl-2和bax表達水平，發現轉染敲降GBE1后，可以加重缺氧造成的的細胞活力降低，增加促凋亡因子cleaved-caspase-3、bax的表達水平，降低凋亡抑制因子bcl-2的表達水平，從而促進細胞凋亡；高表達GBE1則有相反的效果。因此，GBE1能夠促進肺癌細胞缺氧條件下的代謝，從而使細胞產生缺氧耐受，抑制GBE1的表達可以抑制肺癌細胞的缺氧耐受，促進細胞凋亡。

通過GEO基因芯片數據庫進行數據挖掘的方法尋找新靶點和研究方向具有便捷、數據量大的特點，但還需要設計實驗進行驗證。本實驗利用數據庫發現 GBE1的表達與肺癌缺氧顯著相關，并通過A549細胞設計試驗驗證了這一結果，證明了GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用。綜上所述，GBE1可以作為治療肺癌缺氧耐受的新靶點，為未來肺癌臨床治療的研究提供新的方向。

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