橋本甲狀腺炎合并甲狀腺毒癥對小鼠額葉谷氨酸含量的影響

朱 敏，蔡瑤俊，陳章祥，樊 華，賈雪梅，朱德發

甲狀腺毒癥是指血循環中甲狀腺激素過多引發多系統改變的一組臨床綜合征，包括易怒、焦慮及記憶力減退等神經精神癥狀[1-2]。橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis, HT)是產生甲狀腺毒癥的常見原因，能引起甲狀腺毒癥并與其合并存在。 目前有臨床研究[3]顯示甲狀腺功能正常的HT患者即存在神經精神癥狀。谷氨酸作為中樞系統中最主要的興奮性神經遞質，與多種疾病引起的神經精神癥狀有關，其代謝較復雜，可作用于額葉、海馬、扣帶回等邊緣系統及其周圍區域[4]。其中，額葉是影響情緒活動的重要腦區。因此，該研究利用豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin, pTg)建立橋本甲狀腺炎合并甲狀腺毒癥小鼠模型，觀察其額葉谷氨酸含量及分布是否受到影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物5周齡CBA/J雌性小鼠30只，購自南京大學模式動物研究所，動物標準飼養條件下喂養，體質量15～20 g，健康狀況良好。

1.2主要儀器及試劑pTg、弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant, CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant, IFA)(美國Sigma公司)；T3、T4放射免疫試劑盒(北京北方生物技術研究所)；檢測儀器為 DFM-96型16管放射免疫γ計數器；甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody, TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)試劑盒(美國貝克曼公司)；檢測儀器為貝克曼Uni Cel Dxl 800全自動化學發光免疫分析儀；大鼠來源抗谷氨酸單克隆抗體(美國novus公司)；免疫組織化學染色試劑盒(北京中山金橋生物公司)；光學顯微鏡(Olympus DP)；形態學圖像分析系統(Image-ProPlus 6.0)。

1.3動物造模方法CBA/J雌性小鼠適應性喂養一周后初步分為兩組，即正常對照組(n=10)和模型組。待造模結束后模型組按照測定的甲狀腺激素水平分為橋本組(n=10)和甲狀腺毒癥組(n=10)。模型組造模步驟：將pTg溶于PBS溶液中，CFA與pTg溶液1 ∶1混合于研缽中，pTg終濃度為2 mg/ml，冰浴條件下研磨至“油包水”狀，固定好小鼠，行腹腔注射，每只0.1 ml。其余兩組注射等量CFA。第14天將CFA替換成IFA，操作方法同前，其余兩組注射等量IFA。造模周期為49 d。實驗經由安徽醫科大學倫理委員會審核批準。

1.4血清制備及T3、T4、TgAb、TPOAb檢測乙醚吸入麻醉后打開小鼠腹腔，暴露下腔靜脈，用肝素鈉濕潤1 ml注射器，行下腔靜脈采血，室溫下靜置6 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于4 ℃冰箱保存待測血清T3、T4、TgAb、TPOAb。放射免疫試劑盒檢測T3、T4，電化學發光免疫分析法檢測TgAb、TPOAb。

1.5標本制備取血后立即斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，矢狀位連續切片，片厚5 μm。連同氣管分離甲狀腺，于4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm。

1.6HE染色法切片經脫蠟、復水后，蘇木精染料染色20 min，鹽酸乙醇分色、藍化后伊紅染色10 s，再經脫水、透明后烘干封片。光學顯微鏡下拍攝圖片。

1.7免疫組織化學染色法切片脫蠟、復水、微波爐抗原修復后，滴3%過氧化氫溶液溫箱孵育30 min消除內源性過氧化物酶，山羊血清封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(1 ∶400，陰性對照以PBS代替)，山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑顯微鏡下顯色，蘇木精復染3 min，漂洗干凈后脫水封片。光學顯微鏡下拍攝圖片，利用形態學圖像分析系統對圖片進行分析。

2 結果

2.13組小鼠激素及抗體水平與正常對照組相比，橋本組和甲狀腺毒癥組TgAb、TPOAb顯著升高(P<0.01)；橋本組T4較正常對照組差異無統計學意義，甲狀腺毒癥組T4顯著高于正常對照組(P<0.01)，3組間T3差異無統計學意義。見表1。

2.23組小鼠甲狀腺HE染色與正常對照組相比，橋本組和甲狀腺毒癥組小鼠甲狀腺內可見明顯淋巴細胞浸潤及部分甲狀腺濾泡的破壞。見圖1。

2.33組小鼠額葉各層谷氨酸含量比較小鼠額葉按神經元形態分層：Ⅰ層為分子層，細胞結構少，有較多水平纖維；Ⅱ層為外顆粒層，神經細胞顆粒狀排列較整齊、致密；Ⅲ層為外椎體細胞層，此層較寬，椎體細胞大小不等、松散分布，其中有少量星形細胞；Ⅳ層為內顆粒層，由較多星形細胞構成；Ⅴ為內椎體細胞層，主要由大量大、中型椎體細胞及少量星形細胞構成。本實驗小鼠額葉切片各組各層細胞胞核均呈淡藍色，Ⅰ層細胞極少，胞質也極少有棕黃色顆粒分布；Ⅱ～Ⅴ層細胞胞質呈棕黃色，此為谷氨酸免疫反應所產生的陽性產物。肉眼可見甲狀腺毒癥組棕黃色面積大于且顏色深于橋本組和正常對照組，橋本組稍強于正常對照組。見圖2。

表1 3組小鼠T3、T4、TgAb及TPOAb水平(n=30,±s)

與正常對照組比較：*P<0.01

以平均光密度(average optical density, AOD)值作為分析指標，進一步量化分析各組小鼠額葉Ⅱ～Ⅴ層谷氨酸免疫反應產物，結果顯示：甲狀腺毒癥組與正常對照組相比，各層AOD值均顯著增大(P<0.01)；與橋本組比較，各層AOD值差異有統計學意義(P<0.05)。橋本組與正常對照組相比，除Ⅳ外，余3層AOD值差異均有統計學意義(P<0.05)。Ⅰ層細胞結構和棕黃色顆粒極少，未納入統計。見表2。

表2 3組小鼠額葉谷氨酸含量比較(n=30,±s )

與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與橋本組比較：#P<0.05

圖1 小鼠甲狀腺組織HE染色 ×50(見圖中▼標示)A：正常對照組；B：橋本組；C：甲狀腺毒癥組

圖2 谷氨酸免疫產物在各組小鼠額葉的分布情況

3 討論

本實驗選用國際公認的橋本甲狀腺炎造模小鼠CBA/J小鼠，利用豬甲狀腺球蛋白結合弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑造模[5-7]。結果顯示，橋本組小鼠僅表現為TgAb和TPOAb顯著升高及甲狀腺病理切片呈淋巴細胞浸潤等特征性形態學改變。甲狀腺毒癥組小鼠除上述表現外，T4增高，T3與對照組相比差異無統計學意義，但均值仍高于正常對照組，提示造模成功。

研究[8-9]顯示，甲狀腺功能正常時，免疫因素即可成為HT情緒改變的原因，而其產生的具體機制目前鮮有報道。本實驗中，橋本組小鼠額葉Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ層細胞內谷氨酸含量與正常對照組相比有增加。多種疾病引發的神經精神癥狀甚至健康人群存在的情緒改變與腦部谷氨酸代謝異常密切關聯，González-Sepúlveda et al[10]的研究發現，慢性疼痛導致患者出現焦慮癥狀時，其額葉谷氨酸含量呈增加趨勢；商進春 等[11]的動物學研究發現，尿毒癥腦病致大鼠產生神經精神系統癥狀時，其腦組織谷氨酸濃度發生變化；Modi et al[12]在健康人群的研究中發現，焦慮情緒重者前扣帶回內谷氨酸含量高于焦慮情緒輕者。結合以上研究成果，本研究結果提示HT所致的神經精神癥狀可能與小鼠額葉谷氨酸代謝異常有關。此外，可能因為錐體神經元在額葉活動中發揮著主要功能，Ⅳ層主要由星形神經細胞構成，使得橋本組小鼠額葉Ⅳ層相對于其它層受到影響稍小。

本實驗觀察各組小鼠額葉各層谷氨酸分布與含量，發現甲狀腺毒癥組小鼠額葉Ⅱ～Ⅴ層中細胞內谷氨酸含量較正常對照組和橋本組均增高，提示甲狀腺毒癥組小鼠額葉細胞內谷氨酸含量的顯著升高可能是HT和甲狀腺毒癥共同作用的結果，HT合并的甲狀腺毒癥可能會影響小鼠額葉谷氨酸代謝。甲狀腺毒癥導致的神經精神癥狀的產生機制尚不十分清楚。有研究[13-14]顯示，利用左甲狀腺素建立的甲狀腺毒癥大鼠模型腦部多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺等神經遞質發生變化。Zhang et al[15]在對甲狀腺功能亢進癥(甲亢)患者神經精神癥狀機制的研究中發現，甲亢患者扣帶回谷氨酸含量減少。該結果與本實驗結果均提示甲狀腺毒癥可能會導致腦部谷氨酸代謝異常，可能因為選取腦區不同、谷氨酸代謝的調節作用以及疾病病因和進程等不同因素，造成了實驗結果的差異。

綜上所述，HT會導致小鼠額葉細胞內谷氨酸含量增高，合并甲狀腺毒癥時增高更加明顯，該結果可能為HT及HT合并甲狀腺毒癥引發神經精神癥狀的機制探討提供一定參考作用。

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