糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）615 對小麥秸稈木質纖維素降解效果的研究

劉紅菊， 屯妮薩·麥提賽伊迪， 張仕琦， 楊開倫

（新疆農業大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，新疆烏魯木齊830052）

我國小麥種植面積大，每年小麥秸稈達到了1.4 億噸，（高振華和邸明偉，2008；李堅，2008）。但大量的小麥秸稈以燃燒以及填埋的方式處理，造成環境嚴重污染。將小麥秸稈作為粗飼料飼喂反芻動物，不僅提高了小麥秸稈的有效利用率，還可以解決畜牧業飼草料緊缺的問題（Wei等，2009）。但是，小麥秸稈纖維含量高，纖維素達到了41.00%，半纖維素達到了32.51%，木質素達到了15.40%（Lv等，2016），作為反芻動物粗飼料，其適口性差，消化率、利用率低，導致其潛能未被開發出來（王炫清等，2017）。因此，如何降低小麥秸稈中木質纖維素含量，提高反芻動物對小麥秸稈的利用率具有重要意義。目前，小麥秸稈作為粗飼料的主要處理方法有物理法、化學法和微生物發酵法。物理處理時間短、無污染且可提高小麥秸稈適口性，但耗能較大，成本較高，不適于大規模處理（盧松，2010）?；瘜W法處理時間短，秸稈利用率高，但成本高且易造成二次環境污染。微生物處理小麥秸稈是在秸稈中加入有益微生物，微生物在代謝過程中產生漆酶、錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶，其相互作用，可以降低粗纖維的含量，從而可以提高其作為粗飼料的利用價值。研究顯示，秸稈經食用真菌發酵后，對秸稈的木質纖維具有較好的降解能力，可有效降解木質素，保留纖維素并降低干物質損失率。張榮等（2015）研究表明，利用Trichoderma asperellum1285發酵麥秸10 d后，半纖維素和木質素的損失率分別為23.22%、18.01%。糙皮側耳菌株是擔子菌門下傘菌目側耳科一種類，是我國廣泛栽培的食用菌，以農作物秸稈（棉花秸稈、稻草、小麥秸稈等）為底物培養食用菌，采摘子實體后測得秸稈中纖維素、半纖維素以及木質素含量降低，氮含量增加。本試驗首先液體培養糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）615 菌株，研究其產漆酶、錳過氧化物酶的能力；其次利用菌液固體發酵經1.00%CaO處理的小麥秸稈，測定發酵后小麥秸稈中粗蛋白質、纖維素、半纖維素及木質素的含量變化，探究糙皮側耳615對小麥秸稈木質纖維素的降解效果，為豐富小麥秸稈微生物處理技術的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）的配制：去皮馬鈴薯200.00 g切成薄片放入裝有1.00 L去離子水的燒杯中煮沸30 min，用8層紗布將馬鈴薯淀粉液濾出，加入葡萄糖20.00 g、KH2PO43.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、 維生素 B11.00 g 攪拌，溶解，將配制好的PD培養液分裝到三角錐瓶中，塞棉塞，并包報紙2層，線繩扎緊，進行121℃高壓滅菌20 min，冷卻后測得pH為6.0，備用。

1.2 菌種來源 糙皮側耳 （Pleurotus ostreatus）615菌株購于新疆農業科學院微生物研究所。

1.3 種子液的制備 將備用PD培養液分別倒入3個250 mL三角錐瓶中各100.00 mL，并接入糙皮側耳615菌株1.00 g，放入水浴搖床恒溫振蕩器，溫度設為25℃，轉速為150 r/min，培養 5 d，每天觀察菌球生長情況。制得種子液，放4℃冰箱，備用。

1.4 粗酶液的制備 將100.00 mL發酵培養基裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，冷卻后接入5 d菌齡的糙皮側耳615菌株種子液10.00 mL，做3個重復，放入水浴搖床恒溫振蕩器中，溫度設為25℃，轉速為150 r/min，培養10 d。每天取培養液2.00 mL至離心管中，離心（4℃，6000 r/min）10 min，用移液槍吸取上清液于離心管中冷凍（-20℃），保存，直至取到第10天為止。該粗酶液用于測定漆酶、錳過氧化物酶1～10 d的酶活力變化。

1.5 漆酶活力測定 用ABTS的氧化來表示漆酶的活性。其1.50 mL反應體系為：吸取濃度為2.50 mmol/L的2,2-聯氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）500.00μL和濃度為0.10 mol/L的醋酸鈉緩沖液 （pH=4.5）900.00μL，加入100.00μL粗酶液，啟動反應，測定反應5 min內420 nm處吸光度的變化。以轉化1.00μmol ABTS所需的酶量來表示1個酶活力單位（1.00μmol/min）。

1.6 錳過氧化物酶活力測定 用MnSO4的氧化來表示錳過氧化物酶的活性。其1.41 mL反應體系為：吸取濃度為1.43 mmol/L的硫酸錳溶液（即用濃度為 50.00 mmol/L，pH=4.5酸-乳酸鈉鹽緩沖液配置MnSO4溶液）1.35 mL和濃度為0.08 mol/L的H2O2溶液0.05 mL，加入0.05 mL粗酶液，啟動反應，測定反應5 min內270 nm處吸光度的變化。每分鐘使1.00 mmol/L的Mn2+轉化為Mn3+所需的錳過氧化物酶量來表示1個酶活力單位（1.00 μmol/min）。

1.7 糙皮側耳615菌株固體發酵小麥秸稈 稱取100.00 g小麥秸稈原料（粉碎至40目）放入燒杯中，在燒杯中加入1.00%的CaO及100.00 mL去離子水，用玻璃棒攪拌均勻后靜置24 h。將靜置24 h的小麥秸稈裝袋并放入121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，滅菌結束后放在超凈工作臺中冷卻，待接種。試驗分為三組分別為空白組、對照組和試驗組，空白組為未處理的小麥秸稈原樣，對照組為經1.00%CaO處理靜置24 h的小麥秸稈，試驗組為經1.00%CaO處理靜置24 h后接種10%糙皮側耳615菌株種子液的小麥秸稈。

在超凈工作臺中利用糙皮側耳615菌株種子液接種冷卻后的小麥秸稈樣品，接種量為10.00%，將接種后的小麥秸稈樣品25℃發酵30 d，每日觀察發酵情況。

1.8 糙皮側耳615菌株發酵小麥秸稈30 d后飼料常規成分的測定 未處理的小麥秸稈原樣、經1.00%CaO處理靜置24 h的小麥秸稈、糙皮側耳615菌株發酵小麥秸稈樣品干物質的測定采用GB/T6435-2006飼料中水分和其他揮發性物質含量的測定方法進行測定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量采用美國ANKOM纖維分析儀進行測定，并計算出纖維素、半纖維素、木質素含量及降解率，蛋白質采用快速定氮儀測定。

1.9 掃描電鏡分析 將待掃描小麥秸稈樣品用導電膠帶固定在銅臺上，噴金后用日立新型高分辨場發射掃描電鏡SU8010掃描電子顯微鏡觀察。掃描電鏡分析小麥秸稈試樣為未粉碎樣。

1.10 數據計算及處理 試驗結果均以“平均值±標準差”表示，試驗數據采用SPSS18.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）程序進行方差分析，各組間平均值的多重比較采用Duncan法進行。

2 結果與分析

2.1 糙皮側耳615菌株種子液形態與顯微觀察糙皮側耳615菌株液體培養5 d后出現小米粒大小的淡黃色小菌球。糙皮側耳615菌株顯微鏡下菌絲的結構有橫隔和分枝，有鎖狀聯合，菌絲粗細較均勻，較細胞狹長（王茂成，2013）。

2.2 漆酶活力測定 由圖1可知，漆酶活力從第1天～第4天不斷上升，并在第4天達到最大值1428.00 U/L，漆酶活力從第5天開始下降，且在第10天下降到399.00 U/L。

圖1 1～10 d漆酶活力變化

圖2 1～10 d錳過氧化物酶活力變化

2.3 錳過氧化物酶活力測定 由圖2可知，錳過氧化物酶活力從第1天至第5天不斷上升，并在第5天達到最大值15.45 U/L，錳過氧化物酶活力從第6天開始下降，且在第10天下降到4.74 U/L。2.4 菌株發酵小麥秸稈30 d后飼料常規成分的含量 由表1可知，在中性洗滌纖維方面，試驗組顯著低于對照組和空白組（P＜0.05），且分別低了4.23%和4.08，對照組與空白組無顯著性差異（P＞0.05）；在酸性洗滌纖維方面，試驗組顯著高于對照組（P ＜ 0.05），極顯著高于空白組（P ＜ 0.01），且分別高了4.19%和7.24%，對照組顯著高于空白組（P＜0.05），且高了2.93%；在纖維素方面，試驗組極顯著高于對照組與空白組 （P＜0.01），且分別高了37.17%、38.87%，對照組與空白組無顯著性差異（P＞0.05）；在半纖維素方面，試驗組極顯著低于對照組與空白組 （P＜0.01），且分別降低了19.87%、20.89%，對照組與空白組無顯著性差異；在木質素方面，試驗組極顯著低于對照組與空白組（P ＜ 0.01），且分別降低了 43.75%、57.01%，對照組與空白組差異顯著 （P＜0.05），且比空白組低23.57%；在粗蛋白質方面，試驗組極顯著高于對照組與空白組 （P＜0.01），且分別提高了4.14%、3.91%，對照組與空白組無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 糙皮側耳615菌株發酵小麥秸稈30 d后對飼料常規成分含量的影響（干物質基礎）%

2.5 小麥秸稈掃描電鏡結構變化分析 小麥秸稈原樣、1.00%CaO處理后小麥秸稈、糙皮側耳615菌株發酵后小麥秸稈掃描電鏡圖分別見圖3、圖4，圖5。圖3所示在放大5000倍的情況下可以清楚地顯示小麥秸稈原料表面光滑平整，結構致密有規則。圖4所示經1.00%CaO處理后的小麥秸稈表面蠟質層遭到破壞，使得小麥秸稈表面出現裂痕。圖5所示糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）615菌株發酵后小麥秸稈表面出現大量密集孔洞、細絲及膨松狀態片狀結構。

圖3 小麥秸稈原樣掃描電鏡圖（左：外側 右：內側5000×）

圖4 1.00%CaO處理后小麥秸稈掃描電鏡圖（左：外側 右：內側5000×）

圖5 糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）615菌株固態發酵30 d的小麥秸稈掃描電鏡圖（左：外側 右：內側 5000×）

3 討論

3.1 糙皮側耳615菌株液體培養1～10 d過程中漆酶、錳過氧化物酶活力的變化 漆酶和錳過氧化物酶是秸稈中粗纖維降解的關鍵酶，主要產生于真菌。在真菌菌絲生長過程中會分泌大量的漆酶與錳過氧化物酶。木質素的降解主要由漆酶與錳過氧化物酶參與完成。首先，木質素結構中的苯環在酶的催化作用下發生單電子氧化反應形成苯氧自由基；其次，木質素的降解產物被菌絲體吸收，進一步被氧化成二氧化碳和水，從而實現對木質素的降解。因此，提高漆酶與錳過氧化物酶的活力，是實現木質素降解的主要手段。本試驗使用液體培養基培養糙皮側耳615菌株，培養液中漆酶和錳過氧化物酶活性隨著培養時間先升后降。漆酶在培養的第4天活性達到最高，活力為1428.00 U/L，此后漆酶的活力呈下降趨勢，至第10天活力與培養初接近，與范文霞等（2008）以毛云芝菌為菌種進行液體培養（PD）的結果一致，其研究培養到第4天時漆酶的活力達到最高水平，為582 U/mL，且隨著培養時間的延長，其酶活逐漸降低。本試驗中漆酶活力比范文霞等試驗結果中漆酶活力高59.24%，可能因為菌種不同其產酶能力也不同。

池玉杰等（2009）研究表明，在紅平菇降解木質素試驗中以木屑為產酶底物，測得錳過氧化物酶在第11天達到最高，之后隨時間延長逐漸下降。而范鵬珍等（2011）研究也表明，在含Mn2+的LNAS培養基中不加底物條件下培養菌株可檢測到含量較低的錳過氧化物酶，但產酶最佳時間為第13天，出現延后。本試驗錳過氧化物酶在培養的第5天活性達到最高，活力為15.45 U/L，此后酶活開始降低。與池玉杰、范鵬珍等結果相比較，本試驗錳過氧化物酶活性到達最高值的時間明顯縮短，出現這種結果的原因可能與試驗培養基、添加的底物以及菌種有關。池玉杰（2009）在培養菌種過程中以木屑為底物，可能因為菌種生長過程中產生錳過氧化物酶用來降解木屑中的粗纖維而被消耗，直至粗纖維降解結束，才使得錳過氧化物酶活性在第13天達到最大值。在未添加底物條件下，范鵬珍（2011）研究利用低氮天冬酰胺-琥珀酸培養基 （LNAS）培養杏鮑菇和乳白耙齒菌，LNAS培養基除了含有KH2PO4和MgSO4以外，還含有CaCl2等礦物質溶液，該培養基pH為4.5，本試驗PD培養基主要含有馬鈴薯淀粉、葡糖糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4等，且 pH 為 6.0。 因此，培養基的成分不同、pH不同導致范鵬珍等研究產酶時間與本試驗產酶時間不同。在本試驗培養條件下，使用糙皮側耳615菌株作為菌種，以PD作為產酶培養基可以縮短產生錳過氧化物酶的時間。研究表明，在偏堿性培養基中真菌產錳過氧化物酶的活力更高（李旭東等，2006）。本試驗在PD培養基內添加維生素B1，維生素B1可提高培養基pH，可能是使錳過氧化物酶活力達最高值時間縮短的原因。

3.2 糙皮側耳615菌株發酵小麥秸稈30 d后對其營養物質變化的影響 小麥秸稈粗纖維含量高（60%以上），粗蛋白質含量低（3% ～6%）（魏敏，2002）且適口性差，作為粗飼料不能被完全消化，利用率低。目前小麥秸稈作為粗飼料飼喂家畜的方式為直接飼喂或加工成顆粒飼喂，顆粒飼喂方法雖然提高了采食量，但利用率仍然很低（哈麗代·熱合木江等，2014）。因此，小麥秸稈作為粗飼料的有效利用，一是要提高動物對小麥秸稈的采食量，二是要提高小麥秸稈中木質纖維素的消化率。

提高小麥秸稈中木質纖維素 （特別是木質素）的降解率是提高小麥秸稈消化利用的關鍵。木質纖維素的降解主要是通過多種纖維降解酶協同作用來實現的。研究顯示，將真菌接種到棉花秸稈（Shi等，2008）、玉米秸稈（侯進等，2010）、稻草秸稈（李燕榮，2010）），其分泌的超纖維氧化酶可溶解秸稈表面的蠟質，并吸附在木質纖維素的端部，然后，菌絲由端部向內延伸，并產生纖維素酶、半纖維素酶、內切聚糖酶和外切聚糖酶將秸稈降解為小分子碳源和半纖維素，為菌絲的生長和木質素的降解提供碳源和能量（鄧緣，2005；Hadar等，1992）。

張榮等 （2015）研究發現，T.asperellum1285菌株發酵麥秸8 d后纖維素、半纖維素分別降低了9.94%、18.58%。T.asperellum1285菌株發酵麥秸10 d后半纖維素和木質素的分別降低了23.22%、18.01%。本試驗糙皮側耳615菌株固態發酵小麥秸稈30 d后其中性洗滌纖維、半纖維素和木質素分別降低了4.23%、19.87%和43.75%，而小麥秸稈酸酸性洗滌纖維和纖維素含量分別升高了4.19%和37.17%。本試驗半纖維素、木質素降解率明顯高于張榮等（2015）研究結果，纖維素降解率低于其結果?？赡茉蚴菑垬s等發酵麥秸時間與本試驗不同，本試驗發酵時間較張榮等發酵時間長，使得半纖維素、木質素被降解的徹底。侯進等（2010）應用白腐真菌發酵曲種發酵玉米秸稈結果顯示，中性洗滌纖維含量升高，與本試驗研究結果相同。由于菌種不同導致其對纖維素降解能力也不同，且小麥秸稈品種和收獲時期等不同，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量有差異 （朱順國等，2001）。Hadar等（1992）研究發現，平菇發酵棉籽殼三周時，降解木質素作用深入到密集組織中；隨后，植物的木髓部分逐漸被分離出來，導管處的細胞也開始被降解，第四周發現木質素在體外的降解速率逐漸加快，含量明顯降低，所以本試驗中半纖維素及木質素比張榮等第8天、第10天的降解率高。此外，通過電鏡掃描經糙皮側耳615菌株發酵后的小麥秸稈，發現其表面覆蓋的一層蠟質層遭到破壞，菌絲直接進入小麥秸稈內部分泌漆酶、錳過氧化物酶，這兩種酶相互作用對內部纖維素、半纖維素及木質素進行降解，使得小麥秸稈被分解成膨松狀態的片狀結構。此結果進一步證明了糙皮側耳615菌株可降低小麥秸稈中纖維含量。Arora（1995）和Asiegbu等（1996）研究表明，由于白腐真菌不同菌種的生理差異，具有不同的木質素降解酶系，對粗纖維的降解能力也不同。李野等（2008）研究發現，高效降解秸稈木質素的4株側耳屬食用菌類固體發酵小麥秸稈30 d后小麥秸稈中蛋白質含量顯著增加了11.22%。本試驗通過糙皮側耳615菌株發酵小麥秸稈30 d后粗蛋白質增加了4.14%，蛋白質的增加量顯著低于李野等研究結果?？赡芘c處理所用的菌種、發酵條件等有關，因為菌種不同、發酵條件不同，發酵菌的生長量也不同。

4 結論

4.1 糙皮側耳615菌株液體培養過程中，漆酶在第4天達到最大值1428.00 U/L，錳過氧化物酶第5天達到最大值15.45 U/L。

4.2 小麥秸稈經糙皮側耳615菌株固體發酵30 d后，小麥秸稈中的木質素含量、半纖維素含量均顯著降低，粗蛋白質含量顯著升高。

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