蒸制過程中大菱鲆肌肉理化特性、組織結構及蛋白特性變化

傅新鑫，王 垚，李德陽，姜鵬飛，劉文濤，梁 峻，祁立波，董秀萍,*

加熱是肉類加工和食用的主要方式，適當的熱處理可以賦予產品良好的色澤，并且可以殺滅微生物，提升產品品質。傳統的加熱方式有蒸、煮、微波、烘烤等，不同的加熱方式會對肌肉品質造成不同的影響。Yarmand等[1]研究烤、燉、微波加熱的方式對駱駝肉品質的影響，發現微波方式下肌肉的剪切力最大，燉的方式對肌束膜的損傷最嚴重。García-Segovia等[2]研究牛肉在常壓、真空低溫、真空蒸煮等條件下的品質變化，發現不同處理條件下的牛肉組織結構變化明顯不同。董志儉等[3]研究南美白對蝦在蒸制過程中水分和質構的變化，發現蝦肉蒸制不同時間其質構明顯不同，自由水的損失會影響質構的變化。可見，不同來源的肌肉需要選擇適宜的加工方式和加工條件，才能最大限度地保持其營養、口感和外觀。

大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）屬硬骨魚綱，鰈形目，鲆科，菱屬，主要養殖區域集中于山東、遼寧、河北等沿海地區。近年來，隨著養殖技術日趨成熟，養殖產量逐漸攀升，2015年我國鲆魚養殖產量高達13萬 t。目前，專家學者對大菱鲆的研究主要集中在基因[4-5]、疾病[6-7]、育種[8]、優化養殖[9]、飼料配比[10-11]等方面，主要著眼點仍在于如何擴大養殖產量，推進養殖技術的發展，對于加工利用的研究相對較少。部分學者研究了油炸工藝[12]和熏制工藝[13]下大菱鲆魚肉感官的變化情況，以及腌制工藝[14]下其理化指標的變化情況。吳瓊等[15]開展了不同熟化方式（烤制、油炸、微波、蒸制、真空隔水加熱）對大菱鲆質量損失率、色度、質構、組織結構、感官影響的對比研究，發現蒸制是最適合大菱鲆的加工方式，但尚未系統考察蒸制時間對大菱鲆品質的影響。還有一些學者研究了鯉魚[16]、金槍魚[17]、武昌魚[18]等在蒸制過程中的品質變化，但不同品種的魚在蒸制過程中的品質變化及最適宜的加工條件也不盡相同。大菱鲆作為高蛋白低脂肪的優質海魚，富含氨基酸、維生素和礦物質，且肉質鮮美，口感嫩滑，適宜的加工方式和條件有利于保留營養物質，降低由于蛋白質變性、脂肪酸降解等導致的肌肉加工品品質的劣化。因此，本研究考察大菱鲆肌肉蒸制過程中理化指標、組織結構、蛋白特性的變化，探尋適宜的加工條件，為大菱鲆的精深加工和中餐工業化利用提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆原料魚購于遼寧省大連市長興水產市場，魚體長（37.2±1.7）cm，質量（962.3±78.7）g。活魚采用碎冰覆蓋方式運送至實驗室，打頭致死，取上背部肌肉，去皮待用。

考馬斯亮藍G250 索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白 瑞士Fluka公司；氯胺T（分析純） 天津市光復精細化工研究所；高氯酸（優級純） 天津政成化學制品有限公司；對二甲基氨基苯甲醛（分析純） 天津傲然精細化工研究所；VG染液 北京雷根生物技術有限公司；超微量ATP酶（Ca2+Mg2+）試劑盒、總巰基試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TA.XT質構儀 英國Stable Micro Systems公司；UltraScan PRO測色儀 美國HunterLab公司；TP1020自動脫水機、RM2245石蠟包埋機、EG1150C石蠟切片機德國Leica公司；冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；M200酶標定量測定儀 瑞士Tecan Infinite公司。

1.3 方法

1.3.1 蒸制方法

沿大菱鲆主骨方向，將去皮魚片切成1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm規格的魚塊，置于玻璃皿中，覆蓋保鮮膜，于充滿蒸汽的蒸鍋中分別加熱2、4、6、8、10 min，迅速放入冰盒中冷卻10 min后取出，測試相關指標。

1.3.2 肌原纖維蛋白相對提取率

分別稱取新鮮及蒸制后的大菱鲆魚肉2 g，參照Niamnuy[19]和藍尉冰[20]等的方法提取肌原纖維蛋白。參照袁道強等[21]的方法測定蛋白濃度。以新鮮大菱鲆肉的提取率為100%，計算蒸制后大菱鲆魚肉肌原纖維蛋白的相對提取率。

1.3.3 失水率及質量損失率

參照孫麗等[17]的方法測定魚塊的蒸制失水率及質量損失率，參照Dong Xiuping等[22]的方法測定樣品的水分含量，質量損失率按式（1）計算，失水率按式（2）計算。

式中：m1為試樣蒸制前質量/g；m2為試樣蒸制后質量/g；B1為未蒸制試樣水分含量/（g/100 g）；B2為蒸制后試樣水分含量/（g/100 g）。

1.3.4 粗脂肪含量的測定

根據GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》方法測定[23]。

1.3.5 羥脯氨酸含量測定

取1 mL蒸制流失液，參照ISO 3496標準[24]繪制羥脯氨酸標準曲線，按照羅鳳連等[25]的方法對蒸制流失液進行測定。

1.3.6 色度測定

使用色度測試儀檢測新鮮及蒸制不同時間魚塊，使用中孔徑反射進行測定，測試近骨一端，采用三點測試法進行測試，觀察L*、a*及b*值的變化。L*表示亮度，L*值為正值表示顏色偏白，L*值為負值表示顏色偏黑。C*按公式（3）計算。

式中：a*表示紅綠值，a*值為正值表示顏色偏紅色，a*值為負值表示顏色偏綠色；b*表示黃藍值，b*值為正值表示顏色偏黃色，b*值為負值表示顏色偏藍色；C*表示顏色的深淺，C*值越大表示顏色越深，反之，表示顏色越淺。

1.3.7 質構特性測定

1.3.7.1 剪切力測定

探頭型號HDP/BS，測試前速率1 mm/s，測試中速率1 mm/s，測試后速率10 mm/s，數據收集由計算機軟件完成。

1.3.7.2 質構測試

探頭型號P50，測試前速率2 mm/s，測試中速率1 mm/s，測試后速率1 mm/s，壓縮程度60%，時間間隔5 s，壓縮2 次，數據收集由計算機軟件完成。

1.3.8 蛋白相對含量測定

采用考馬斯亮藍染色法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），使用分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%。上樣后先采用8～15 mA電泳電流，樣品進入濃縮膠后提高到15～30 mA，電泳時間2 h左右。電泳完畢后，染色，脫色，直至有清晰的條帶出現后，使用凝膠成像儀分析結果。

1.3.9 魚塊組織結構觀察

參照劉世新[26]的方法制作石蠟組織切片。將處理后的肌肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的小塊，依次進行固定、梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、脫蠟等步驟。

采用苦味酸-酸性品紅染色法，基本步驟為將復紅染液和PA溶液按1∶9（V/V）的比例混合后染色組織切片7 min，然后用去離子水沖洗，用濾紙吸干載玻片上組織塊周圍的水分，再依次放入無水乙醇、二甲苯中各浸泡10 min，組織塊晾干后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.10 魚塊Ca2+Mg2+-ATPase活力測定

按照超微量ATP酶（Ca2+Mg2+）試劑盒說明書進行測定。

1.3.11 魚塊總巰基含量測定

按照總巰基試劑盒說明書進行測定。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0中One-way ANOVA 模型進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蒸制不同時間大菱鲆魚塊理化特性的變化

2.1.1 蒸制不同時間大菱鲆魚塊理化指標含量的變化

圖1 蒸制過程中大菱鲆魚塊肌原纖維蛋白相對提取率（A）、失水率和質量損失率（B）、脂肪含量（C）及流失液羥脯氨酸含量（D）的變化Fig. 1 Changes in relative extraction rate of myofibrilar protein (A),water loss rate, mass loss rate (B), crude fat (on a wet basis) content (C) in turbot cubes and total thiol group content in exudate (D) during steaming

由圖1A可知，蒸制過程中肌原纖維蛋白相對提取率不斷降低，蒸制前2 min相對提取率迅速下降到12%，加熱4 min時低于10%，此時魚塊達到熟化態[27]。蒸制初期，肌原纖維蛋白由于受熱變性使得肌原纖維蛋白相對提取率迅速降低，繼續加熱，肌原纖維蛋白降解加劇，同時魚塊組織出現變形。隨著蒸制時間延長，肌束膜受熱破損并逐漸加劇，肌原纖維蛋白從肌纖維間逐漸流失到組織外，這應該也是導致肌原纖維蛋白相對提取率持續下降的原因。

由圖1B可知，蒸制過程中，大菱鲆魚塊的質量損失率和失水率均呈現上升趨勢，其變化速率均先上升再下降，在蒸制8 min時均達到最大值，分別為3.62%/min和0.86%/min，整個蒸制過程中質量損失率明顯高于失水率。肌纖維及結締組織受熱后會發生收縮、拉伸變化，從而導致肌肉外形的變化，并伴有汁液流失，且受熱時間越長，汁液流失越多，外形變化也越大。肌肉受熱過程中流失的汁液中包括水分、變性的蛋白質和脂肪[28]，因此，質量損失率要高于失水率。蒸制初期，魚塊表層蛋白質發生變性，肌原纖維蛋白含量不斷降低，繼續加熱，魚塊受熱外形發生變化，縮短了魚塊中心至表面的距離，從而提高了汁液流失速率[17]，蒸制至8 min時，魚塊變形最嚴重，此時的質量損失率和失水率的變化速率也最快。因此，為了避免營養的流失及組織形狀變化過大，大菱鲆魚塊的蒸制時間應不超過8 min。

由圖1C可知，新鮮魚塊中脂肪含量較低，僅為（0.88±0.05）%，在蒸制2 min時顯著降低（P＜0.05），蒸制4 min后沒有顯著變化（P＞0.05）；這可能是由于脂肪受熱到一定程度后同流失液一起流失到組織外，而由于季節、魚體大小的不同，不同魚塊的脂肪含量也會有所不同。

由圖1D可知，蒸制過程中，大菱鲆魚塊的蒸制流失液中羥脯氨酸含量不斷升高，羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性氨基酸，其含量變化可以反映膠原蛋白的含量變化；因此，隨著蒸制時間的延長，大菱鲆魚塊的膠原蛋白的流失量在不斷升高。從圖2可以看出，魚塊在蒸制4 min時其肌束膜緊密程度降低，在蒸制8 min時肌束膜不斷溶解；因此推測可能是高溫加熱使結締組織不斷溶解，導致了魚塊的膠原蛋白不斷變性溶出[29]。

2.1.2 蒸制不同時間大菱鲆魚塊色度、質構的變化

由表1可知，與新鮮樣品相比，蒸制2 min時魚塊的L*值迅速上升，亮度增加，蒸制4 min后變化不大，亮度趨于穩定。研究表明，當球蛋白構象破壞，亞鐵血紅素氧化被取代后，可造成L*值增大[30]。蒸制過程中魚塊的a*值呈現先迅速下降，后趨于平穩的趨勢。研究表明，當亞鐵肌紅蛋白被氧化成高鐵肌紅蛋白時，會導致a*值顯著下降（P＜0.05），且熱處理過程導致的VE、色氨酸等營養素損失也會使肉色度下降[30]。蒸制過程中，魚塊的b*值先升高再降低，其中6 min時b*值最大，可能因為受熱初期脂肪熔融，導致b*值升高，隨著受熱時間延長，肌纖維蛋白變性收縮，束縛了脂肪，b*值下降[31]。顏色飽和度C*值呈上升趨勢，但變化不顯著（P＞0.05），可見加熱有助于加深肉色，使肉顏色更鮮亮，但大菱鲆魚肉是白肉，所以加熱后其主要變化是亮度變化，即肉色變白，而不是飽和度變化，因此飽和度變化不顯著（P＞0.05）。

表1 蒸制過程中大菱鲆魚塊色度、質構的變化Table 1 Changes in color and texture of turbot cubes during steaming

肉制品在加熱過程中，肌原纖維蛋白和結締組織是影響肉制品剪切力的兩大因素，加熱過程中，二者的張力發生變化，從而影響剪切力的變化。從表1可以看出，隨著加熱時間的延長，大菱鲆魚塊的剪切力顯著下降（P＜0.05），其中新鮮和蒸制2 min樣品的剪切力沒有顯著性差異（P＞0.05），可能是由于蒸制2 min時，魚塊受熱時間較短，魚塊中心部位的肌肉纖維還沒有熟化，使得魚塊仍保有初始剪切力值。蒸制2～4 min的魚塊剪切力顯著降低（P＜0.05），可能是此時的肌原纖維蛋白含量顯著降低（P＜0.05），且肌纖維發生收縮導致。蒸制4 min后，魚塊剪切力變化不明顯。研究表明，加熱過程中肌肉組織中維系蛋白質分子結構的各種共價鍵和非共價鍵逐漸出現斷裂，一般在30～32 ℃時，肌原纖維蛋白失去高級結構，開始溶解，在50～60 ℃時，膠原蛋白開始變性，致使膠原纖維收縮，這些蛋白質的熱變性會導致剪切力的變化[32]。

肉的硬度與其肌原纖維蛋白和膠原蛋白的性質和比例有關。大菱鲆魚塊在蒸制過程中硬度和咀嚼性降低，可能是肌原纖維蛋白變性、結締組織收縮及肌動球蛋白脫水收縮共同作用的結果[33]。

2.2 蒸制不同時間大菱鲆魚塊組織結構的變化

圖2 蒸制過程中大菱鲆魚塊組織結構觀察（200×）Fig. 2 Microstructural change of turbot cubes during steaming (200 ×)

由圖2可知：宰殺后的大菱鲆魚塊的組織略微松散；蒸制2 min，魚塊的肌纖維受熱膨脹，組織緊密程度有所提高，肌束膜完整并緊密地包裹著肌纖維；蒸制4 min時肌纖維開始收縮，肌束膜連接的緊密程度降低；蒸制6 min時包裹的肌束膜的緊密性更弱；蒸制8 min時肌纖維斷裂在橫切面產生孔洞，肌束膜破損，結締組織液體化，隨水分流出[29]；蒸制10 min時肌束膜破損更加嚴重。肌束膜的主要成分是膠原蛋白，這與圖1D的流失液羥脯氨酸含量所反映的肌肉膠原蛋白流失含量的變化趨勢相同。魚塊肌纖維在蒸制4 min時開始收縮變細，而此時的魚塊的剪切力也降至較低值，可見肌纖維的直徑對魚塊的剪切力影響較大。

2.3 蒸制對大菱鲆魚塊和流失液蛋白質的影響

2.3.1 蒸制對大菱鲆魚塊Ca2+Mg2+-ATPase活力、總巰基含量的影響

圖3 蒸制不同時間大菱鲆魚塊Ca2＋Mg2＋-ATPase活力（A）、總巰基含量（B）的變化Fig. 3 Changes in Ca2+Mg2+-ATPase activity (A) and total sulfhydryl content (B) in turbot cubes during steaming

Ca2+-ATPase是肌球蛋白的活性頭部，其活性的變化可以反映肌原纖維蛋白的變性情況。圖3A中可看出，隨著蒸制時間的延長，Ca2+Mg2+-ATPase活力先小幅升高然后緩慢下降，蒸制2 min時酶活力達到最低點且之后無顯著性變化（P＞0.05）。由于蛋白質之間存在氫鍵、二硫鍵等作用力，受熱后，維持蛋白質構象的作用力被破壞，改變了蛋白質原有構象，進一步加熱后，蛋白質的活性部位遭到破壞，導致酶活力下降。蒸制5 s時，酶活力略有升高，可能是蛋白質構象在受熱初期發生聚集而引起的暫時性升高[34]。Ogawa等[35]研究鯉魚肌球蛋白熱穩定性時，發現加熱到30 ℃時鯉魚的肌球蛋白結構開始發生變化，而大菱鲆魚塊在蒸制30 s時中心溫度約為55 ℃[36]，由于疏水氨基酸和巰基的共同作用，其酶活力開始下降，而蒸制1 min時中心溫度已高于70 ℃[36]，隨后酶活力大幅度下降，說明此時的肌球蛋白活性頭部已被完全破壞。這與圖1A所示的肌原纖維蛋白相對提取率的變化趨勢相同。

由圖3B可以看出，隨著蒸制時間的延長，總巰基含量先大幅升高后不斷下降，最后趨于穩定。這是由于受熱初期，魚塊中蛋白質間部分作用力被破壞，暴露了部分活性巰基，使總巰基含量增加，之后由于溫度不斷升高，蛋白質發生交聯，生成二硫鍵，使得總巰基含量減少[34]。潘錦鋒等[34]在研究草魚肌原纖維蛋白熱穩定性時發現草魚肌肉的總巰基含量在40 ℃開始減少，60～70 ℃大幅降低，而大菱鲆魚塊在蒸制15 s和1 min時，其中心溫度分別達到39.9 ℃和75.4 ℃[36]。從圖3B可以看出，大菱鲆魚塊的總巰基含量在蒸制10 s后顯著下降（P＜0.05），在蒸制1 min時大幅降低，這與潘錦鋒等[34]的研究結果一致。

2.3.2 蒸制不同時間大菱鲆魚塊肌原纖維蛋白和流失液的SDS-PAGE變化

圖4 蒸制不同時間大菱鲆魚塊的肌原纖維蛋白（A）和流失液（B）的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE of myofibrilar proteins (A) and exudate (B) in turbot cubes subjected to different steaming times

肌球蛋白是肌原纖維的主要組成部分[37]。如圖4A所示，從未蒸制和蒸制不同時間的魚塊中提取出的肌原纖維蛋白中，包括兩種主要的蛋白條帶，即肌球蛋白重鏈和肌動蛋白。新鮮和蒸制2 min的肌原纖維蛋白的電泳圖譜中隱約看到肌球蛋白輕鏈和一些小分子蛋白；隨著蒸制時間的延長，魚塊肌原纖維蛋白中的各種蛋白均在減少，部分小分子蛋白消失。加熱過程中，魚塊流失液中的蛋白質主要是肌漿蛋白等水溶性蛋白和一些相對分子質量較小的多肽化合物，或肌原纖維蛋白的降解產物及重新聚合的大分子聚合物。由圖4B可以看出，加熱初期，魚塊中低分子蛋白受熱變性發生降解，蛋白亞基種類較多；進一步加熱，低分子蛋白含量減少。條帶6顯示的是蒸制10 min的結果，低分子蛋白條帶幾乎全部消失，而高分子蛋白條帶明顯變寬且顏色加深，可能是由于隨著蒸制時間的延長，流失液中的低分子蛋白彼此連接，重新聚集成為高分子蛋白，使高分子蛋白的濃度有所增加，或是低分子蛋白已完全水解。在對魚塊進行生產加工的過程中會產生大量的蒸煮液，而這些蒸煮液中所含有的蛋白質種類和含量較為豐富，具有一定的營養價值，可以考慮利用蒸煮液，提高資源附加值。

3 結 論

大菱鲆魚塊蒸制后在理化特性、組織結構和蛋白特性方面均發生不同程度的變化。蒸制2 min時，魚塊中的Ca2+Mg2+-ATPase活性被破壞，大分子蛋白質降解成小片段，肌原纖維蛋白相對提取率大幅降低。蒸制4 min時，肌原纖維蛋白相對提取率降至10%以下，魚塊達到熟化狀態；熟化魚塊剪切力降至較低值，具有較好的嫩度和亮度。繼續受熱，魚塊的剪切力、L*值基本不變，但由于肌束膜緊密程度不斷降低甚至溶解，導致水分、膠原蛋白等營養物質持續流失。因此，限定規格（1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm）魚塊蒸制4 min即可達到熟化，此時組織完整，營養物質流失較少，顏色和嫩度適宜。

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