基質輔助激光解吸電離質譜成像技術及其在食品分析中的應用

殷小鈺，陳 倩，韓 齊，孔保華*

基質輔助激光解吸電離質譜成像（matrix-assisted laser desorption mass spectrometry imaging，MALDIMSI）技術是利用MALDI質譜技術，通過質譜儀測定離子的質荷比（m/z）來分析生物分子的標準分子質量，并結合專門的質譜成像軟件輔助產生分子圖像的新型分析技術。該技術最早于1997年由Caprioli和同事一起提出[1]。同傳統的分析技術相比，MALDI-MSI技術無需提取、分離、純化待測樣品，具有檢測分子質量范圍廣、靈敏度高、操作簡便、自動化水平高等特點[2]。隨著MALDI-MSI技術的發展，其已被廣泛應用于生命科學領域，如動植物生理學[3]、病理學[4]、藥物研發及療效監控[5]等。基于MALDI-MSI技術的諸多優點，近幾年來其在食品科學領域中也得到了應用[6]。本文主要介紹MALDI-MSI技術樣品制備及其在食品分析中的應用，并對其發展方向進行了展望。

1 MALDI-MSI的成像原理

MALDI-MSI技術需要使用冰凍切片機對被研究的組織進行切片處理，獲得極薄的組織切片后用基質進行覆蓋，然后將干燥結晶后的切片組織置于質譜儀的靶上進行成像分析。該技術的原理是以軟電離技術MALDI為基礎，將分析物分散在基質分子中并形成晶體。用紫外（ultra-violet，UV）和紅外（infrared，IR）的激光束照射晶體時，由于基質分子經輻射所吸收的能量蓄積并迅速產熱，基質晶體升華，進而使樣品從表面解吸進入氣相，基質和分析物發生膨脹，進行氣相質子交換反應形成離子[7]。然后利用MALDI系統的質譜成像軟件分析樣品組織，將質譜儀所獲得的樣品上每個點的m/z信息轉化為照片上的像素點。在每個樣品點上，將所有質譜數據經平均化處理獲得一幅代表該區域內化合物分布情況的完整質譜圖。儀器逐步采集質譜數據，最后得到具有空間信息的整套樣品的質譜數據，完成對組織樣品的“分子成像”。設定m/z的范圍，即可確定該組織區域所含生物分子的種類，選定峰高或者峰面積來代表生物分子的相對豐度[8]。一般通過質譜成像可獲取組織切片的二維圖譜，在組織發育的過程中，將用連續切片獲取的二維圖譜組合，可繪出樣品組織中靶分子的三維圖譜，以分析其空間結構[9]。MALDI-MSI的工作流程如圖1所示[10]。

圖1 典型MALDI-MSI組織分析的工作流程[10]Fig. 1 Typical MALDI-MSI workflow for tissue analysis[10]

2 MALDI-MSI樣品制備

MALDI-MSI技術的關鍵在于樣品的制備方法和基質的選擇。對于植物組織和動物組織，MALDI-MSI技術的樣品制備方法已經逐漸成熟，因此，在食品分析中，肉類樣品處理方法可參照哺乳動物組織進行處理，蔬菜和水果樣品可參照植物組織進行處理。

2.1 樣品組織的收集及貯藏

在MALDI-MSI成像中，樣品的質量對內部化合物的分布有很大的影響，并且由于樣品不能直接用來成像，因此，樣品的處理和貯藏是能否獲得高質量圖像的關鍵因素。樣品的收集和處理的過程一定要快速，因為組織一旦被分離，其內部物質就會發生降解。一般情況下將樣品凍藏一段時間，直至分析前取出，樣品的貯存時間取決于樣品的性質，但是在樣品的貯藏期間也要考慮分析物質的降解和遷移[11]。還有研究人員將樣品放在液氮或干冰與不同溶劑混合的低溫浴中快速冷凍，但不建議直接將樣品放入液氮中，以免組織發生斷裂或破碎。Schwartz等[12]將新鮮的組織放入到塑料試管中以避免這種情況的發生。也有研究人員建議采用-70 ℃下的乙醇和異丙醇來代替液氮[13]。

2.2 切片

在用冰凍切片機切片時，需要用支持物對樣品進行包埋，為切片提供支持。形狀較規則的大樣品可以用少量的去離子水直接固定在切片機試樣夾里，但是較小的樣品則需要用支持物進行包埋[14]。常用的支持物有石蠟、冰、質量分數10%明膠和羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）溶液等[15]。在食品分析中，切片的厚度取決于樣品性質和儀器的限制。一般情況下，組織切片的厚度為10～20 μm[16]。近年來也有研究人員發現，在分析高分子質量的物質（3～21 kDa）時，用2～5 μm厚度的樣品切片可以獲得高質量的圖像[17]。切片之后，通過融裱或雙面膠帶將樣品轉移到質譜成像的靶上。

2.3 組織預處理

2.3.1 組織切片的沖洗

通常，在用基質覆蓋之前，最好洗滌或漂洗組織切片，除去一些抑制目標分子電離的內源分子和鹽，加重信號，以免產生復雜的圖譜。也有研究人員認為，組織切片沖洗前須在真空或氮氣中脫水，減少濕度對分析的影響。一般情況下使用酒精來清洗切片。對于脂肪含量較高的組織，一般用氯仿或二甲苯等溶液進行清洗。Enthaler等[18]研究表明，組織切片的沖洗會導致切片中蛋白質含量大幅降低。因此，在清洗過程中應避免除去一些成像的目標小分子，以獲得高質量的圖譜。另一種組織切片的洗滌方法是用溶劑濕潤的無纖維紙局部清洗組織切片[19]。這種局部清洗的方法適用于易碎的組織切片，可以用來對比清洗區域和未清洗區域。

2.3.2 切片組織消化

利用MALDI-MSI技術分析蛋白質時，由于該技術具有探測上限，無法探測大分子蛋白質，因此在對大分子蛋白質分析前，需要對其進行組織消化獲得小肽段[20]。隨后，再通過MALDI-MSI技術用得到的小肽段的空間信息定位母蛋白質。組織消化是利用蛋白酶處理組織切片，產生多個小肽段。由于MALDI-MSI技術可鑒定蛋白酶水解后的小肽段，因此MALDI-MSI技術也適用于鑒定分析未知的蛋白質。

2.4 基質的選擇及覆蓋方法

2.4.1 基質的選擇

在MALDI成像中，基質的類型和覆蓋方法是獲得高質量可重復的離子圖像的關鍵[21]。由于激光束的不同，MALDI-MSI可分為紫外質譜成像（UV-MALDI-MSI）和紅外質譜成像（IR-MALDI-MSI），與UV-MALDI-MSI相比，IR-MALDI-MSI的主要優點是樣品中的內源水可以作為基質吸收紅外輻射。但是，在分析的過程中，靈敏度可能會因為水分的不均勻分布而發生變化[22]。

在利用UV-MALDI-MSI對食品成分分析時，常用的基質為2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、芥子酸（sinapinic acid，SA）和α-氰基-4-羥基苯丙烯酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA），其中，SA主要適用于高分子質量的蛋白質，在分子質量約為4 kDa的高分子化合物（如蛋白質和肽）的分析中，SA可以提供更好的信噪比[23]。Cavatorta等[24]利用MALDI-MSI技術分析桃中的變應原時，選擇了SA作為基質，獲得了高質量的圖譜。DHB、9-氨基吖啶（9-aminoacridine，9-AA）和CHCA適用于分析低分子質量的物質。另外，基質混合物的應用可以改善電離效率和信號強度[23]。Lemaire等[11]在MALDI-MSI中，使用CHCA-二甲基苯胺混合液作為基質復合物，研究發現相比于單獨使用CHCA，CHCA-二甲基苯胺基質復合物形成了致密且均勻的基質層，其信號強度更高。

2.4.2 基質的覆蓋方法

基質對分析物的覆蓋方法是能否獲得高質量圖譜的重要因素，其方法大致可分為濕法和干法。用于濕法覆蓋分析物的設備有手動式氣噴霧器、壓電高頻振動基質噴霧器、聲控微滴噴射器和化學打印噴射器[25]。其中手動式噴霧器是最早也是最常用于基質噴涂的工具，該方法簡單易行，但是人工操作會導致每次噴霧的均勻度不一致，因此，獲得均勻的基質涂層很大程度上依賴于操作者的熟練程度[26]。濕法覆蓋分析物應該在噴霧和干燥反復循環的條件下操作，每次噴霧要達到剛好潤濕切片的效果。根據組織表面性質的不同，循環次數一般為3～10 次。基質干燥涂層法是將基質和樣品一同放在真空室里，加熱基質，冷卻樣品，使基質直接升華到冷卻后的樣品上，大大降低了分析物的離域。然而，對于需要摻入基質晶體中的分析物，其信號強度相對較差[27]。

3 MALDI-MSI在食品成分分析中的應用

食物中含有碳水化合物、脂質和蛋白質等營養成分，有些食物還含有一些內源性毒素。對這些成分進行常規的化學方法分析時操作步驟繁瑣，需要提取、分離分析物質，然后采用高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法等進行分析。而MALDI-MSI技術作為一種快速高效的分析技術，可以克服這些缺點，近些年在食品分析中得到了應用。

3.1 對食品中碳水化合物的分析

碳水化合物在生命活動過程中起著重要的作用，是生物體維持生命活動所需能量的主要來源，可分為單糖、二糖、寡糖和多糖。水果和蔬菜中的糖類主要有蔗糖、葡萄糖、果糖等，這3 種成分的含量在不同水果和蔬菜中是不同的。在草莓、香蕉、葡萄、西紅柿和茄子的組織切片中呈現出多樣化的空間分布[28-29]。

Li Yue等[28]利用MALDI-MSI技術在草莓的表皮組織和種子中發現了豐富的蔗糖（圖2）。蔗糖是碳素同化物的主要轉移形式，也是植物器官的碳骨架和無法進行光合作用時器官的能量來源。Berisha等[30]利用MALDI-MSI技術探索葡萄的外果皮和種子中糖類的空間分布，發現單糖主要分布在葡萄的外果皮中，而二糖主要分布在中果皮里。目前，質譜成像技術在碳水化合物中的應用主要集中在單糖和二糖等糖類的檢測[6]，而在一些化學結構復雜的碳水化合物實驗中還存在著許多問題。通過MALDI-MSI技術獲得的碳水化合物的空間分布信息有助于我們探索水果和蔬菜中碳水化合物的生物合成和代謝途徑，控制果蔬在貯藏與加工過程中營養成分的變化，以保持和改善果蔬及其加工制品的感官品質。

圖2 草莓表皮與嵌入的種子周圍的3 個主要成分的MALDI-MSI圖像[28]Fig. 2 Optical image of a strawberry skin compared to MALDI-MSI images for three major components around embedded seeds[28]

3.2 對食品中脂質的分析

脂質是生物體內一大類微溶于水、溶于有機溶劑的物質，它的種類和品質的好壞直接影響著食品的風味、質地和顏色。尤其是肉制品，在不良的條件下進行貯藏極易發生氧化。脂質氧化會生成低級脂肪酸、醛、酮等物質，它們具有刺鼻的不良氣味，影響肉類的風味、質地、顏色和營養。因此控制和減少脂質氧化是肉類食品科學中研究的重點。傳統的分析手段可以實現對脂質含量、分布及氧化程度的分析，但是在脂質提取過程中物質的分布信息會有所缺失，無法達到分子水平。而MALDI-MSI技術通過添加基質保護促進了樣品的電離。Dyer等[31]首先根據脂質在質譜中的相對豐度，確定出磷脂、甘油三酯和膽固醇為標記物，隨后利用MALDI-MSI技術繪制了脂質氧化降解產物的空間分布圖，研究了不同的包裝條件（高氧、空氣和真空）對牛背最長肌在貯藏期間脂質氧化的影響。

圖3 牛背最長肌中磷脂酰膽堿（m/z 760.6）和未確定脂質（m/z 428.2）的離子強度的空間異質性[31]Fig. 3 Observed spatial heterogeneity of the ion intensities of a phosphatidylcholine (m/z 760.6) and an unidentified lipid(m/z 428.2) in bovine M. longissimus dorsi lumborum[31]

圖4 高氧包裝牛背最長肌中心和邊緣的磷脂酰乙醇胺（m/z 744.4）的離子圖像[31]Fig. 4 Ion images of phosphatidylethanolamine (m/z 744.4) from one bovine M. longissimus dorsi lumborum, sub-sampled, packaged in high-oxygen modified atmosphere from the center and from the edge[31]

圖5 高氧包裝牛背最長肌中心和邊緣的溶血磷脂酰膽堿（m/z 496.3）的離子圖像[31]Fig. 5 Ion images of a lysophosphatidylcholine (m/z 496.3) from one bovine M. longissimus dorsi lumborum, sub-sampled, packaged in high-oxygen modified atmosphere from the center and from the edge[31]

如圖3所示，可明顯觀察到肌肉的大理石紋。結果表明，肉中的脂質分布具有空間異質性，在高氧的條件下，磷脂酰乙醇胺（圖4）和磷脂酰膽堿（圖5）的相對豐度快速下降，膽固醇顯示出相對較高的氧化穩定性。Zaima等[32]也利用MALDI-MSI技術觀察了不同產地牛肉中的脂質空間分布，根據樣品中的脂質組成不同，將牛肉樣品進行了分組，不同組別中的牛肉脂質含量并沒有顯著差異。因此，在同位素分析鑒定樣品之前，可以利用MALDI-MSI技術對脂質組分含量沒有顯著差異的牛肉樣品進行簡單的分類。在允許檢測的范圍內，研究人員可以利用MALDI-MSI技術快速檢測和分析肉類組織切片中的內源性脂質，評估肉類在生產、加工、包裝、貯藏和流通中脂質氧化降解程度，以最大限度地提高食品質量與價值。也可將該技術與代謝組學方法結合評估牛肉來源的真實性，以確保消費者食用健康無污染的肉類制品。

3.3 對食品中蛋白質的分析

MALDI-MSI技術也被用來快速定位蛋白質和一些小肽。眾所周知，脂質轉移蛋白廣泛分布于動物、植物和微生物中，是植物生命活動中一類重要的活性蛋白質[33]，其中脂質轉移蛋白Pru p 3是桃中的主要變應原，能夠引起人體的超敏反應，造成組織損傷或生理功能紊亂[34]。Bencivenni等[35]利用MALDI-MSI技術對西紅柿的果皮、果肉和種子進行了成像。觀察發現，西紅柿中的非特異性脂質轉移蛋白主要存在于種子區域，果皮和果肉組織中并未觀察到，若除去西紅柿的種子，可以大大減少西紅柿制品中非特異性脂質轉移蛋白的含量，這為生產低變應原的農產品提供了技術支持。

圖6 桃的MALDI-MSI圖像[24]Fig. 6 MALDI-MSI image of peach[24]

Cavatorta等[24]在桃的MALDI-MSI圖像中觀察到，如圖6所示，脂質轉移蛋白（Pru p 3變應原）只存在于桃的外果皮中，這與用免疫組織化學法研究的結果一致[36]，人對桃的過敏反應與桃皮中的Pru p 3變應原有關。此外，還有研究人員對大豆子葉進行了成像觀察，通過分析蛋白質的空間分布，對不同的樣品進行了區分，并深入研究了不同植物的生長遺傳差異。Grassl等[37]利用MALDI-MSI技術研究了大豆中的植物蛋白，首先用胰蛋白酶將切片組織消化成多個小肽，結果發現每一種肽都呈現出完全不同的定位分布。這些研究表明MALDI-MSI可以用于研究食品中的蛋白質或肽的分布。

3.4 對食品中其他成分的分析

MALDI-MSI技術也可用來分析和定位食品中的一些生物活性成分。眾所周知，黃酮類化合物存在于自然界的植物中，具有良好的抗氧化活性和抗癌活性[38]。Berisha[30]和Yoshimura[39]等分別在葡萄和藍莓的成像中發現，二者花色苷的分布高度相似，花翠素和矮牽牛苷定位在葡萄的外果皮，花青素、芍藥素等其他花色苷分布在葡萄的外果皮和內果皮[37]，在藍莓的外果皮中也同樣定位到這些花色苷[39]。通過分析可知，葡萄和藍莓中花色苷的定位取決于糖苷配基而不是糖基。此外，Zaima等[40]通過MALDI-MSI技術鑒定水稻中的代謝產物，發現γ-谷維素和植酸位于麩皮中，生育酚分布在胚芽中。Tairi等[41]選用了CHCA作為基質，利用MALDI-MSI分別觀察了辣椒的胎盤、果皮、種子區的辣椒素，圖像顯示，與其他部分相比，胎盤區的辣椒素信號強度最強，并且在胎盤表面更豐富。由此可見，通過質譜成像技術獲得的空間信息將有助于了解這些生物活性成分相關基因的表達模式，可以更好的篩選代謝物和食源性營養因子，了解其在食品中的生物學意義。此外，MALDI-MSI技術也可用于食品中一些有毒有害物質的檢測。馬鈴薯中含有一種弱堿性的生物堿，致毒成分是茄堿，又稱馬鈴薯毒素，食用過量會引起惡心、嘔吐、呼吸衰竭等癥狀。Cabral等[42]通過MALDI-MSI技術檢測到在馬鈴薯芽中馬鈴薯毒素的含量最多，周皮的α-卡茄堿和α-茄堿的豐度比髓質區分別高出5 倍和2 倍。

圖7 馬鈴薯塊莖中的α-卡茄堿（m/z 852.4）和α-茄堿（m/z868.4）的MALDI-MSI圖像[43]Fig. 7 MALDI-MSI images of α-chaconine (m/z 852.4) and α-solanine (m/z 868.4) from a section of potato tuber[43]

Ha等[43]利用MALDI-MSI技術研究發現，如圖7所示，當馬鈴薯的塊莖暴露在光照下時，顏色變綠，生物堿的含量發生變化，與髓部相比，塊莖周皮中的生物堿含量顯著增加（P＜0.05）。

這些應用實例表明，MALDI-MSI技術可以準確的繪制出食品中營養成分和有害物質的空間分布圖像，這種可視化分布能夠有效的幫助我們分析食品中的營養成分：從而有助于探索果蔬中碳水化合物的生物合成和代謝途徑，理清其作為結構物質在果蔬質構方面的作用及其在果蔬貯藏與加工過程中的變化與控制，以保持和改善果蔬及其加工制品的感官品質；有助于快速評估肉類制品在生產、加工、包裝、貯藏與流通中脂質氧化降解的程度，以最大限度地提高食品質量和價值；有助于了解食品中某些生物活性成分相關基因的表達模式，更好的篩選代謝物和食源性營養因子；有助于檢測和監控食品中一些有毒有害的物質，幫助我們在分子水平上監測食品質量和安全。

4 結 語

MALDI-MSI在食品分析中的應用雖然起步較晚，研究有限，但是憑借其無需標記靶分子、無需提取待測物質、分子質量范圍廣、具有成像能力等優點在食品分析中取得了一定的進展。但其在具體的實驗中還存在著許多問題：一方面，對于組織中蛋白質和多肽鑒定一直是研究質譜成像技術的難點，尤其是未知蛋白質的鑒定，通常利用原位酶切技術可以提高鑒定的成功率，但是仍然會受到目標蛋白分布散亂、豐度較低等因素的干擾，難以得到理想的實驗結果；另一方面，在研究食品中某些含量較低的營養物質或有毒有害物質時，對實驗的靈敏度或空間分辨率要求較高，因此在實驗中，應合理的選擇基質的類型和覆蓋方法，并對其進行實驗優化[7]。

利用MALDI-MSI技術獲得的化合物空間分布信息，可以在生產中強化食品營養元素，改善食品加工和包裝技術，以及人工定向干預改變代謝產物和篩選食源性營養因子，加強對食品的質量與安全的保障。目前，MALDI-MSI技術在肉品中的應用甚少，未來可以嘗試利用該技術研究定位肉品中的風味物質，根據獲得的空間分布圖分析肉品中風味物質的生成機制，減少風味物質的損失。同時，也可將MALDI-MSI技術與其他技術相結合，如拉曼光譜技術[44]、近紅外光譜技術等[45]，使MALDI-MSI技術在食品研究中的應用前景更加廣闊。

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