不同熱處理大豆蛋白柔性與結構的關系

王 健，徐曄曄，于 潔，張 旭，王喜波*，江連洲

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）由于其良好的功能性質、營養(yǎng)價值及潛在的健康益處而一直是國內外的研究熱點，并被廣泛應用于食品的多個領域[1-3]。蛋白質的柔性可以理解為蛋白質所處外部環(huán)境變化時，其結構能夠發(fā)生改變的能力，反映出蛋白質結構對環(huán)境變化的敏感性[4-6]。因其在決定蛋白功能性質尤其是界面性質中的關鍵作用而受到越來越多學者的關注。Tang Chuanhe等[7]研究牛血清白蛋白結構與功能性質發(fā)現，柔性越高的蛋白越易在界面形成更好的黏彈性蛋白膜，從而表現出更好的乳化性質。Kato等[8]利用不同蛋白對胰蛋白的敏感性來表征柔性，結果發(fā)現起泡性、乳化性與蛋白柔性具有較好的相關性。Tang Chuanhe[6]、Nakai[9]等認為相比于表面疏水性，蛋白柔性在決定SPI乳化性時起著更為決定性的作用。江連洲[10]總結現有食用蛋白質加工技術，首次提出蛋白質柔性化加工技術概念，即通過物理、化學及生物等加工方式改變蛋白質天然的剛性結構，使其柔性化，從而提高蛋白的功能性質。雖然柔性在蛋白質功能性質中的作用得到廣泛的關注[11-13]，但用胰蛋白酶的敏感性表征蛋白柔性來研究柔性與蛋白結構的關系還鮮有報道。

柔性蛋白比剛性蛋白對胰蛋白酶更加敏感[8]，本實驗利用SPI對胰蛋白酶的敏感性表征柔性，研究不同熱處理條件對SPI柔性與結構的影響，并分析它們之間的關系，以期為進一步研究柔性在SPI結構與功能性質中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆由東北農業(yè)大學大豆研究所提供；三氯乙酸永華精細化學品有限公司；十二烷基硫酸鈉、Tris、胰蛋白酶、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針 美國Sigma公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T18 Basic型高速分散機/勻漿機 德國IKA公司；LD4-2A低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；TU-1800型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；ALC-310.3型分析天平 德國艾科勒公司；紫外分光光度計 美國布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；恒溫數顯水浴鍋 賽普實驗儀器廠；滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Sorgentini等[14]方法并略作改動。大豆粉碎后過60 目篩，乙醚低溫脫脂，脫脂后豆粕與蒸餾水以1∶10（m/V）的比例混合，調pH值至8.5，室溫低速攪拌2 h溶解。4 000×g離心20 min，取上清液，調pH值至4.5，4 ℃靜置過夜，去上清液，4 000×g離心5 min，水洗沉淀，離心兩次，復溶后調pH值至7.0，冷凍干燥。

1.3.2 SPI成分測定

蛋白質量分數測定：GB 5009.5-2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；水分質量分數測定：GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》中直接干燥法；灰分質量分數測定：GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》；粗脂肪的測定：GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.3 樣品制備

將SPI溶于緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液），質量濃度為20 mg/mL，室溫攪拌2 h，再用分散機10 000 r/min處理1 min，水化過夜。

1.3.4 熱處理

將制備好的SPI樣品在不同溫度60、70、80、90、100 ℃（水浴）、121 ℃（滅菌鍋）下處理5、10、30 min，迅速用冰水冷卻5 min備用。

1.3.5 柔性測定

參照Kato等[15]的方法略作修改。利用SPI對胰蛋白酶的敏感性來表征并量化柔性。取250 μL 1 mg/mL胰蛋白酶（溶于0.05 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液）溶液加入到4 mL 1 mg/mL熱處理后蛋白溶液中（V（蛋白）：V（酶）＝16∶1），38 ℃保溫酶解5 min，酶解反應結束后，加4 mL 體積分數5% 三氯乙酸溶液終止酶解反應，離心后取上清液測定其在280 nm波長處吸光度，用吸光度A0表示柔性。

1.3.6 濁度測定

濁度的測定參照Kurganov等[16]的方法，并略作改動，將熱處理后的SPI樣品溶液用去離子水稀釋至3 mg/mL，混合均勻后于400 nm波長處測定其吸光度，即為濁度值。

1.3.7 游離巰基含量測定

游離巰基的含量測定參照Beveriger等[17]的方法，并略作改動。取1 mL不同熱處理后SPI樣品（10 mg/mL）加入到5 mL的Tris-Gly緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，然后加入20 μL DTNB試劑，振蕩混勻，在室溫下靜止反應15 min，412 nm波長處測定吸光度，以不加DTNB的溶液做空白調零。游離巰基含量按下式計算。

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；ρ為固形物質量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數。

1.3.8 表面疏水性測定

參照Hayakawa等[18]方法并略作改動。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將SPI樣品溶液稀釋到0.100 00、0.050 00、0.002 50 mg/mL和0.001 25 mg/mL，然后加入20 μL的ANS（8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）熒光探針，混勻后在室溫下避光15 min后測定樣品的熒光強度，設定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，測得的熒光強度對蛋白溶液質量濃度作圖，選擇線性關系良好的回歸曲線斜率作為蛋白質表面的疏水性指數。

1.3.9 紫外光譜掃描

參照Liang Haini等[19]的方法并略作改動。熱處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進行紫外光譜掃描，波長范圍為250～310 nm，掃描速率為100 nm/min，分辨率為0.2 nm。

1.3.10 內源色氨酸熒光光譜

參照Liu Yan等[20]的方法并略作改動，熱處理后的SPI樣品用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋到0.2 mg/mL進行測定，設定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進行熒光光譜掃描，所有測定重復3 次。

1.4 數據統(tǒng)計分析

每次實驗做3 次平行，結果用 ±s表示，數據統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，組間差異顯著性采用t檢驗分析（P＜0.05）；實驗數據用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SPI成分及質量分數

實驗所制得的SPI蛋白質、水分、灰分和粗脂肪質量分數分別為（87.22±0.44）%、（3.24±0.67）%、（3.39±0.53）%和（0.47±0.56）%，符合實驗要求。

2.2 熱處理對SPI柔性與結構的影響

2.2.1 熱處理溫度對SPI柔性的影響

圖1 不同熱處理條件對SPI柔性的影響Fig. 1 Flexibility of soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖1可知，處理溫度低于80 ℃，熱處理對SPI柔性影響不顯著，當溫度高于80 ℃，SPI柔性隨著處理溫度的增加和時間的延長而增加，在121 ℃、30 min時達到最大。有文獻表明SPI中7S變性溫度在70 ℃以上，而11S的變性溫度大約在95 ℃左右[21]。處理溫度低于70 ℃，熱處理不足以破壞SPI的剛性結構，所有熱處理對柔性影響不顯著，而高于80 ℃熱處理會破壞維系SPI剛性結構的共價和/或非共價作用[21-22]（如范德華力、氫鍵、靜電相互作用、二硫鍵、疏水作用等）從而造成SPI柔性的增加。

2.2.2 熱處理溫度對SPI濁度的影響

圖2 不同熱處理條件對SPI濁度的影響Fig. 2 Turbidity of soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖2可知，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，SPI濁度逐漸增加，并在100 ℃處理條件下達到最大，熱處理溫度高于100 ℃，隨著SPI柔性持續(xù)增加，濁度卻發(fā)生了顯著下降。Cromwell等[23]認為濁度與溶液中聚集體大小和數量有關，處理溫度在60～100 ℃，柔性的增強有利于SPI聚集體的形成而導致濁度的上升，處理溫度為121 ℃時柔性與濁度表現出相反的變化趨勢，可能是由于121 ℃高溫會使SPI形成較大的聚集體（實驗過程中發(fā)現有沉淀產生）從而導致濁度的下降，但會持續(xù)破壞維系SPI剛性結構的化學鍵（如二硫鍵，圖3）從而導致SPI柔性的增加。

2.2.3 熱處理溫度對SPI游離巰基含量的影響

圖3 不同熱處理條件對SPI游離巰基含量的影響Fig. 3 Content of free sulfhydryl groups in soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖3可知，熱處理溫度高于60 ℃，SPI游離巰基含量隨柔性上升而上升，在121 ℃處理5 min時達到最大，隨后游離巰基含量隨著時間的延長而下降。原因可能是當SPI柔性上升到某一個值時，柔性的增加反而有利于斷裂生成的游離巰基在冷卻過程中發(fā)生重排，形成新的二硫鍵，從而導致游離巰基含量的下降。

2.2.4 熱處理溫度對SPI表面疏水性的影響

由圖4可知，SPI表面疏水性與濁度表現出相同的變化趨勢，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，SPI表面疏水性隨柔性增加逐漸增大，在處理溫度為100 ℃時達到最大，隨后又下降。可能的解釋為在一定范圍內柔性的增加伴隨著原來隱藏在SPI內部的疏水基團暴露在外從而導致表面疏水性的上升，而在121 ℃處理條件下形成的柔性更大的松散肽鏈在冷卻過程中易發(fā)生疏水相互作用引起蛋白質的疏水聚集，導致SPI表面疏水性的降低。121 ℃處理條件下SPI表面疏水性的降低和游離巰基含量上升的結果與Wang Jinmei等[24]研究結果相似，他們認為在這種情況下聚集體更易由疏水相互作用穩(wěn)定，部分游離巰基內卷于聚集體內部，抑制了分子間二硫鍵的形成，以維持蛋白的柔性構象。

圖4 不同熱處理條件對SPI表面疏水性的影響Fig. 4 Surface hydrophobicity of soy protein isolate under different heating treatment conditions

2.2.5 熱處理SPI的紫外光譜分析

圖5 熱處理10 min SPI紫外吸收光譜Fig. 5 UV spectra of SPI with 10 min heating treatment

蛋白質產生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團對紫外光的吸收作用，據蛋白質對紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質分子在溶液中構象的變化[25]。由圖5可知，熱處理溫度在80～100 ℃范圍，SPI紫外吸收強度隨著柔性的增加而增加，表明隨柔性增加，SPI分子內部發(fā)色基團暴露在外部，SPI結構變得更加舒展。而當處理溫度上升到121 ℃過程中，紫外吸收強度隨柔性的繼續(xù)上升而下降（5、30 min處理條件結果相似），可能是因為聚集體的形成（2.2.2節(jié)）導致暴露在外部的發(fā)色基團重新隱藏在內部從而導致紫外吸收強度的降低[25]。

2.2.6 熱處理SPI的內源色氨酸熒光光譜分析

圖6 熱處理10 min SPI內源色氨酸熒光光譜Fig. 6 Typical intrinsic emission fluorescence spectra of SPI with 10 min heating treatment

蛋白質內源熒光強度及發(fā)射波長主要取決于暴露于溶液環(huán)境中的酪氨酸和色氨酸殘基的極性，或者兩者之間的相互作用。當蛋白質結構展開，發(fā)色團暴露于溶劑中會導致溶液熒光強度的降低[26-27]。由圖6可知，不同的熱處理條件，并沒有導致SPI在最大發(fā)射波長發(fā)生偏移。然而，熱處理溫度在60～100 ℃范圍，所有經過熱處理的SPI樣品的熒光強度都降低，原因可能是熱處理導致SPI的柔性增加，使得更多的發(fā)色團暴露于溶劑中發(fā)生熒光猝滅從而導致熒光強度降低，這與Liang Haini等[19]的研究結構一致，他們認為一定濃度尿素處理能降低牛血清白蛋白內源性色氨酸熒光強度。而當處理溫度繼續(xù)升到121 ℃時，熒光強度隨柔性的繼續(xù)上升又有了輕微上升（5、30 min處理條件結果相似），這與2.2.5節(jié)的結果一致，推測也可能是由于較大聚集體的形成導致。

2.3 SPI柔性與結構關系分析

相關性分析指出，當熱處理溫度范圍在60～100 ℃時，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性呈顯著正相關關系，相關性系數分別為0.956、0.954、0.954。SPI濁度、游離巰基含量與表面疏水性隨柔性上升而上升，其中濁度與柔性相關性最好，其次分別為游離巰基含量和表面疏水性。

為進一步確定SPI柔性與結構的關系，將處理溫度在60～100 ℃的柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性分別進行曲線擬合，結果如圖7所示。

圖7 SPI柔性與濁度（A）、游離巰基含量（B）、表面疏水性（C）擬合曲線Fig. 7 Fitting curves of turbidity (A), free sulfhydryl group content (B),and surface hydrophobicity (C) of SPI as a function of flexibility

處理溫度在60～100 ℃范圍，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性的多項式擬合模型函數分別為y＝-1.937 57+10.640 22x-10.866 98x2、y＝-42.404 3+210.036 8x-198.824 56x2、y＝-1 674.016 59+8 421.410 56x-9 259.539 27x2，其中擬合度分別為0.911 24、0.902 59、0.915 15。濁度、游離巰基含量、表面疏水性在60～100 ℃范圍都能與柔性進行較好的擬合，且擬合度都在0.900 00以上，表明SPI濁度、游離巰基含量和表面疏水性與柔性有較強的相關性。

3 結 論

熱處理溫度低于80 ℃時，對SPI柔性影響不顯著，熱處理溫度高于80 ℃時，SPI柔性隨處理溫度的增加和時間的延長而增加。

熱處理溫度在60～100 ℃范圍，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性呈顯著正相關關系，相關性系數分別為0.956、0.954、0.954。熱處理溫度在100～121 ℃范圍時，濁度、表面疏水性隨著柔性上升而下降，游離巰基含量隨著柔性的上升繼續(xù)上升，在121 ℃、5 min到達最大值，隨后又下降。

熱處理溫度在80～100 ℃范圍時，隨著SPI柔性的增加，其結構更加舒展。

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