菊苣酸對蛋白質氧化損傷的作用

肖海芳，楊淑青，王旭光，王 靜，宋元達,*

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物體的正常代謝產物，主要存在于細胞線粒體中。適量ROS對于維持機體細胞正常的生理功能至關重要。當機體處于氧化應激和疾病狀態時，體內ROS生成增多，過多的ROS攻擊蛋白質、脂質和DNA等生物大分子，進而破壞細胞結構和功能，最終導致神經退行性疾病、炎癥、癌癥和動脈粥樣硬化等疾病的發生[1-5]。

蛋白氧化已成為反映和衡量生命過程中氧化應激和氧化損傷的重要手段[6]。蛋白發生降解以及蛋白羰基的形成是蛋白氧化的主要特征[7-8]。研究發現許多疾病如阿爾茨海默癥、糖尿病、心腦血管等均與蛋白羰基化水平升高有關[9-12]。蛋白質的側鏈氨基酸（尤其是脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸）被氧化后發生羰基化；自由基通過α-酰胺途徑和谷酰基殘基氧化途徑誘導蛋白質肽鏈發生氧化斷裂，生成蛋白羰基化衍生物；半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基的親核側鏈與脂質過氧化產物醛類物質（如4-羥基壬烯醛、丙二醛和2-丙烯醛）及還原糖反應產物活性羰基衍生物的二級反應也會產生羰基化合物[13]。目前，蛋白質羰基化水平是應用最多、最廣泛的蛋白氧化指標[14-15]。檢測蛋白羰基水平的方法很多，其中較為靈敏的方法是采用二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）對羰基進行衍生，形成穩定的2,4-二硝基苯基腙，該物質能夠吸收紫外光，因此可通過分光光度法進行檢測[16]。另外，還可采用特異性Anti-DNP抗體，通過免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白羰基表達[17]。

食用植物中存在的天然抗氧化劑對于預防氧化應激相關疾病具有重要意義。菊苣酸作為天然多酚類化合物，已被證明能夠清除自由基，具有較強的抗氧化能力[18]。然而目前仍未見從生物大分子角度探討菊苣酸抗氧化作用的報道。因此，本研究采用Cu2+/H2O2和2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）兩種不同的自由基誘導體系，分別產生羥自由基和烷氧自由基，誘導牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、小鼠肝臟蛋白和腦蛋白3 種蛋白模型氧化損傷，探討菊苣酸對蛋白質氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性昆明小鼠20 只，體質量（20±2）g，購自第四軍醫大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（陜）2007-001。

考馬斯亮藍R250 西安沃爾森生物技術有限公司；放射免疫沉淀測定（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液 碧云天生物技術研究所；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、硫酸鏈霉素 科邦生物有限公司；DNPH、三羥甲基氨基甲烷 美國Amresco公司；二抗 美國Santa Cruz公司；0.45 μm孔徑聚偏二氟乙烯（polyvinylidene chloride film，PVDF）膜 美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、化學發光檢測試劑盒（electrical chemiluminescence immunoassay，ECL） 美國Thermo Fisher公司；甘氨酸 德國Merck公司；菊苣酸（純度≥98%）、BSA、AAPH、Anti-DNP抗體 美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DY89-Ⅱ型勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；5419R型高速離心機、移液槍 德國Eppendorf公司；PowerPac 220V電泳供電裝置、165-8001型垂直電泳槽、221BR型Trans-Blot SD半干轉印槽、ChemiDox XRS凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；-80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型萬分之一天平 德國Sartorius公司；VORTEX-5型漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；QYC110臺式恒溫振蕩器 上海福瑪實驗設備有限公司；生化分析型超純水機 成都優普凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織蛋白的提取

本實驗中所有動物的處理，遵循山東理工大學實驗室動物管理辦法的規定。小鼠于20～22 ℃、相對濕度45%～50%條件下飼養，以基礎飼料喂養，自由飲水，實驗前將小鼠禁食過夜，次日頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟組織和腦組織，置4 ℃生理鹽水中反復漂洗，剔除脂肪及結締組織，用濾紙吸干水分。稱取0.1 g肝臟或腦組織，迅速剪碎，置于玻璃勻漿器中，加入1 mL RIPA細胞裂解液及10 μL PMSF溶液，冰水浴中勻漿，繼續裂解10 min，然后于4 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液，即為組織總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定組織總蛋白濃度。

1.3.2 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導蛋白氧化損傷的影響

Cu2+與H2O2反應能夠產生羥自由基，引起蛋白質氧化[6]。取0.6 mg/mL的BSA溶液（以100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液溶解）或組織蛋白（肝臟組織和腦組織）放入多支1.5 mL的離心管中，向實驗組離心管中分別加入不同濃度的菊苣酸溶液，混合均勻。封口膜封口后置于37 ℃水浴中孵育，30 min后取出，分別向各離心管中加入一定濃度的H2O2和CuSO4溶液，使其終濃度分別為25 mmol/L和0.1 mmol/L；對照組不加H2O2和CuSO4溶液，以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替。將各離心管于37 ℃水浴中繼續孵育，90 min后分別檢測各蛋白樣品氧化損傷程度。

1.3.3 菊苣酸對AAPH誘導蛋白氧化損傷的影響

蛋白樣品與菊苣酸的孵育方法同1.3.2節。將AAPH溶液置于37 ℃水浴2 min，使其熱分解。實驗組分別向各孵育后的樣品中加入一定體積濃度為500 mmol/L的AAPH溶液，使其終濃度為50 mmol/L；對照組不加AAPH溶液，以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替。將各樣品于37 ℃水浴鍋中繼續孵育4 h，分別檢測蛋白樣品氧化損傷程度。

1.3.4 SDS-PAGE檢測蛋白損傷程度

分別向1.3.2節和1.3.3節處理好的蛋白樣品中加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，混勻，置于95 ℃水浴中反應10 min，使蛋白變性。取等量各變性后的蛋白樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）90 min后，置于0.1%考馬斯亮藍R250染色液中染色30 min，脫色后采用ChemiDox凝膠成像系統對膠片成像，Quantity One軟件對條帶灰度進行半定量分析。

1.3.5 Western blot檢測蛋白羰基化水平

分別取1.3.2節和1.3.3節處理好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，方法同1.3.4節。電泳結束后，剝離凝膠，于電轉槽中恒壓10 V半干式轉印至PVDF膜上。將轉印后的PVDF膜放入2 mol/L的鹽酸溶液中浸泡10 min，再將其放入20 mmol/L的DNPH鹽酸溶液中衍生30 min。洗滌數次后將膜置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫封閉2 h。TBST洗膜數次后，將膜放入稀釋的Anti-DNP一抗中孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌后放入稀釋的二抗中，室溫輕搖孵育2h。上述PVDF膜經TBST洗滌后采用ECL發光液于ChemiDox凝膠成像系統成像，Quantity One軟件對條帶灰度進行半定量分析。

1.4 數據統計分析

實驗數據以 ±s表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行Duncan’s多重比較分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 菊苣酸對BSA氧化損傷的影響

2.1.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導BSA氧化損傷的影響

圖1 菊苣酸對Cu2/誘導BSA氧化損傷的影響（SDS-PAGE檢測）Fig. 1 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to BSA (detected by SDS-PAGE)

與對照組相比，BSA經Cu2+/H2O2單獨誘導后，圖1中BSA條帶明顯變淺（P＜0.01），圖2中BSA羰基化水平明顯升高（P＜0.01），說明Cu2+/H2O2誘導體系產生的羥自由基使BSA發生明顯的氧化降解和羰基化修飾。與Cu2+/H2O2單獨處理組相比，菊苣酸預先孵育組的BSA條帶灰度明顯升高（P＜0.01），羰基化水平明顯下降（P＜0.01），并且濃度越高，菊苣酸的作用效果越顯著；其中，1 000 μmol/L菊苣酸幾乎能夠完全抑制Cu2+/H2O2誘導的BSA氧化損傷。以上結果說明，100～1 000 μmol/L菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導的BSA氧化損傷具有保護作用。

圖2 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導BSA羰基化的影響（Western blot檢測）Fig. 2 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced carbonylation of BSA (detected by Western blot)

2.1.2 菊苣酸對AAPH誘導BSA氧化損傷的影響

圖3 菊苣酸對AAPH誘導BSA氧化損傷的影響（SDS-PAGE檢測）Fig. 3 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to BSA (detected by SDS-PAGE)

圖4 菊苣酸對AAPH誘導BSA羰基化的影響（Western blot檢測）Fig. 4 Effect of chicoric acid on AAPH-induced carbonylation of BSA(detected by Western blot)

在不同的誘導體系中抗氧化物的活性存在差異，為進一步探討菊苣酸在其他誘導體系中對BSA氧化損傷的影響，本實驗采用熱分解的含氮化合物AAPH誘導BSA發生氧化損傷。由圖3可見，經50 mmol/L AAPH單獨誘導后，大部分BSA被氧化降解；由圖4可見，與對照組相比，BSA羰基化水平也明顯升高（P＜0.01），說明AAPH能夠誘導BSA氧化損傷。采用10～1 000 μmol/L菊苣酸預處理后：由圖3可見，BSA蛋白條帶灰度與AAPH單獨處理組相比明顯加深（P＜0.01）；由圖4可見，羰基化水平明顯下降（P＜0.01）；另外，隨著濃度的增加，其菊苣酸對BSA的作用效果越明顯。上述結果說明菊苣酸對AAPH誘導的BSA氧化損傷也具有明顯的保護作用。

2.2 菊苣酸對小鼠組織蛋白氧化損傷的影響

動物肝臟和腦組織中蛋白含量較高，本實驗選用小鼠肝臟蛋白和腦蛋白作為蛋白模型，以羰基化水平為檢測指標，進一步探討菊苣酸對組織蛋白氧化損傷的影響。

2.2.1 菊苣酸對小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

2.2.1.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

圖5 菊苣酸對Cu2/誘導小鼠肝臟蛋白羰基化的影響Fig. 5 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation in mouse liver

蛋白羰基化條帶灰度越高，說明其氧化損傷程度越高。由圖5可以看出，Cu2+/H2O2單獨作用能引起肝臟蛋白羰基化水平的明顯升高。與Cu2+/H2O2單獨組相比，經10～100 μmol/L菊苣酸預先孵育后，Cu2+/H2O2誘導體系中的小鼠肝臟蛋白羰基化水平無明顯變化，但500 μmol/L菊苣酸能明顯降低小鼠肝臟蛋白的羰基化水平；當菊苣酸濃度增加為1 000 μmol/L時，小鼠肝臟蛋白的羰基化水平與其他各處理組相比均明顯升高。上述結果表明，菊苣酸在一定濃度范圍內能夠對Cu2+/H2O2誘導小鼠肝臟蛋白氧化損傷具有保護作用，但高濃度菊苣酸表現出促氧化作用。

2.2.1.2 菊苣酸對AAPH誘導小鼠肝臟蛋白氧化損傷的影響

由圖6可以看出，AAPH單獨處理后，小鼠肝臟蛋白的羰基化水平明顯升高。10 μmol/L菊苣酸對AAPH誘導的小鼠肝臟蛋白羰基化修飾無明顯抑制作用，而菊苣酸在100～1 000 μmol/L濃度范圍內能夠有效抑制AAPH誘導小鼠肝臟蛋白羰基的產生，對小鼠肝臟蛋白氧化損傷具有明顯的保護作用，且菊苣酸濃度越高對AAPH誘導體系中小鼠肝臟蛋白的保護效果越好。

圖6 菊苣酸對AAPH誘導小鼠肝臟蛋白羰基化的影響Fig. 6 Effect of chicoric acid on AAPH-induced protein carbonylation in mouse liver

2.2.2 菊苣酸對小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

2.2.2.1 菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

圖7 菊苣酸對Cu2＋/小鼠腦蛋白羰基化的影響Fig. 7 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation in mouse brain

由圖7可以看出，與空白組相比，經Cu2+/H2O2誘導體系單獨處理的小鼠腦蛋白羰基化水平明顯升高。經10、100 μmol/L菊苣酸預先孵育后，小鼠腦蛋白羰基化程度明顯下降，說明該濃度范圍內菊苣酸對Cu2+/H2O2誘導體系中的小鼠腦蛋白具有保護作用。當菊苣酸濃度分別增加至500、1 000 μmol/L時，小鼠腦蛋白羰基化水平反而明顯升高，甚至超過Cu2+/H2O2單獨處理組。這一結果說明，在Cu2+/H2O2誘導體系中濃度過高的菊苣酸對小鼠腦蛋白表現出促氧化作用。

2.2.2.2 菊苣酸對AAPH誘導小鼠腦蛋白氧化損傷的影響

由圖8可見，經終濃度為50 mmol/L的AAPH誘導后，小鼠腦蛋白羰基化程度明顯升高。濃度為10 μmol/L的菊苣酸對AAPH誘導的小鼠腦蛋白羰基化無明顯抑制作用，但經濃度分別為100、1 000 μmol/L的菊苣酸預先孵育后，小鼠腦蛋白的羰基化程度明顯下降。上述結果說明，在AAPH誘導體系中濃度為100～1 000 μmol/L菊苣酸表現出抗氧化作用，對小鼠腦蛋白具有明顯的保護作用。

圖8 菊苣酸對AAPH誘導小鼠腦蛋白羰基化水平的影響Fig. 8 Effect of chicoric acid on AAPH-induced protein carbonylation in mouse brain

3 討 論

Cu2+與H2O2反應生成羥自由基，AAPH熱分解產生烷過氧自由基，兩種反應體系均能誘導生物大分子蛋白質發生氧化損傷。大量研究顯示，天然抗氧化劑能夠抑制自由基對蛋白的氧化損傷[6,19-21]。本實驗利用上述兩種典型的氧化誘導體系，在預實驗的基礎上，分別以BSA、小鼠肝臟蛋白和腦蛋白為蛋白模型，研究菊苣酸對蛋白質氧化損傷的影響。

本研究結果表明，無論是通過SDS-PAGE觀察蛋白降解情況，還是Western blot檢測蛋白羰基化水平，菊苣酸在100～1 000 μmol/L濃度范圍內能夠抑制Cu2+與H2O2誘導體系對BSA的氧化損傷；低濃度菊苣酸對羥自由基引起的小鼠肝臟蛋白和腦蛋白氧化損傷具有保護作用，但在高濃度時菊苣酸表現出促氧化作用。與Cu2+/H2O2反應體系不同，在AAPH誘導體系中，高濃度菊苣酸對BSA、小鼠肝臟蛋白和小鼠腦蛋白均表現出較強的保護作用。菊苣酸之所以在兩種反應體系中表現出不同的作用效果，可能是由兩種體系中自由基的性質及在生物大分子上的作用位點不同引起[22]。

據文獻[23-24]報道，VC和VE分別與Cu2+共同作用，均能引起蛋白和DNA的氧化損傷；類黃酮類物質能夠與過渡金屬反應，加速羥自由基的生成[25-26]；高劑量注射VC后，豚鼠血清脂質過氧化水平升高[27]。上述研究結果均表明，許多抗氧化劑在某些情況下能夠表現出促氧化效應。在Cu2+與H2O2誘導體系中，高濃度菊苣酸對小鼠組織蛋白表現出促氧化作用，可能與Cu2+與H2O2反應體系本身有關。Cu2+與H2O2反應產生羥自由基的原理為[28]：Cu2++H2O2→Cu++HO2·+H+，H2O2+Cu+→OH·+OH-+Cu2+。由反應式能夠看出，Cu2+向Cu+的轉變是生成羥自由基的限速步驟，高濃度菊苣酸加入后可能促進了Cu2+向Cu+的轉變，進而加速羥自由基的產生，促進蛋白質氧化，這一推測有待于進一步研究證實。前期研究也曾發現，菊苣酸能夠誘導3T3-L1前脂肪細胞內ROS的產生[29]。另外，在Cu2+/H2O2誘導體系中，高濃度菊苣酸對BSA和小鼠組織蛋白表現出不同的作用效果，這一差異可能與小鼠組織蛋白的成分較為復雜有關。菊苣酸促氧化的作用機制還需要進一步深入探討。

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