單寧酸通過抑制TRAF6向細胞質膜的招募抑制Akt信號通路

阮海華，胡雙艷，張春晨，曹 婳，張 真

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱Akt）信號通路是生物體內一條非常重要的生存信號通路[1-2]。EGFR主要是通過二聚化后刺激Ras蛋白，導致磷酸化級聯反應激活Akt信號通路，故有學者將其稱為EGFR/Akt信號傳導通路[3]。EGFR/Akt信號傳導通路在實體腫瘤，如黑色素瘤、肝癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌和白血病中發揮重要的作用，促進細胞侵襲遷移、加速細胞周期進程、促進細胞增殖[4]。明確該信號通路在腫瘤細胞中的作用機制，尋找阻斷該信號通路的靶向藥物是國內外的研究熱點之一。

植物多酚是來源于植物的次級代謝產物，大量的研究表明植物多酚具有抗突變[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗菌[8]等生物學活性。單寧酸屬于易溶于水的植物多酚類化合物，在紅葡萄酒、茶葉、水果中均含量較多[9]。最新的研究發現，單寧酸能夠作用于乳腺癌細胞EGFR，誘導乳腺癌細胞發生凋亡[10]。在本實驗室前期研究中，通過檢測EGFR全酪氨酸位點的磷酸化發現，單寧酸處理顯著抑制了由表皮生長因子誘導的EGFR的磷酸化，而且具有位點特異性。例如，單寧酸能夠抑制EGFR Y1068和Y1045的磷酸化，進而抑制受這些特異位點磷酸化調控的信號傳導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路，阻斷受STAT3信號通路調控的基因表達，促進細胞凋亡。實際中眾多研究表明，腫瘤的發生與發展是多因素、多基因、多途徑的結果。除了STAT3信號通路，在大部分人惡性膠質瘤細胞以及頭頸癌細胞中，EGFR/Akt信號通路均存在不同程度的失調。然而，單寧酸對EGFR/Akt信號通路的調節作用仍不清楚。本研究發現單寧酸抑制EGFR的磷酸化，改變腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis receptor-associated factor 6，TRAF6）蛋白的亞細胞定位，而TRAF6亞細胞定位的改變介導了單寧酸對Akt信號通路的調控，抑制人膠質瘤U87細胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

人膠質瘤U87細胞由東京大學醫學院Jun-Ichiro Inoue教授提供。

單寧酸（CAS號1401-55-4，相對分子質量為1 701.20） 美國Sigma-Aldrich公司；Gibco胎牛血清、Protein A/G免疫沉淀磁珠 美國Thermo Fisher Scientific公司；HyClone? DMEM高糖培養基 美國GE Healthcare公司；磷酸化EGFR（Tyr1068）抗體、EGFR抗體、磷酸化Akt（S473）抗體、Akt抗體（鼠源）、TRAF6抗體（鼠源）、磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1（eukaryotic translation initiation fator 4E-binding protein 1，4EBP-1）抗體、磷酸化S6抗體 美國Cell Signaling Technology公司；微管蛋白、小窩蛋白1、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯二抗 美國Santa Cruz Technology公司；TRAF6抗體（兔源）、Akt（兔源） 美國Millipore公司；電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒、VigoFect轉染試劑 威格拉斯生物技術（北京）有限公司；3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS）細胞增殖試劑盒（G3850） 美國Promega公司。

pcDNA3質粒由西南大學李洪濤博士惠贈；編碼EGFR vIII突變體的基因序列為從EGFR cDNA序列（GenBank：BC094761.1）中去除編碼第2～7位外顯子間，即去除第241～870位核苷酸的序列。進行全基因合成后，克隆至pcDNA3質粒中。

其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

細胞培養皿 美國Corning公司；HERACELL 150i CO2培養箱 美國Thermo Fisher公司；SpectraMax M5多功能讀板機 美國Molecular Device公司；Trans-Blot SD半干轉印槽、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Alpha Imager Mini凝膠成像系統 美國Protein Simple公司；5430R小型臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

人膠質瘤U87細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基（完全培養基）中，并置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，以質量分數0.25%胰蛋白酶消化傳代。當單層細胞融合度達到70%～80%時進行單寧酸處理。處理培養基為完全培養基內含80 μmol/L單寧酸，每組3 個復孔，培養24、48、72 h后，用細胞刮刀刮取細胞，并收集至離心管中。

1.3.2 MTS法檢測單寧酸對U87細胞增殖的影響

U87細胞以6×104個/mL的濃度接種于96 孔板內，每孔100 μL培養基。24 h后棄培養基，分別加入100 μL含80 μmol/L單寧酸的完全培養基，培養24、48、72 h，每組3 個復孔。采用MTS細胞增殖試劑盒測定OD490nm值。

1.3.3 蛋白質印記法檢測U87細胞蛋白質的表達和磷酸化

均采用蛋白質印記法。細胞處理方法同1.3.1節，收集細胞，參照文獻[11]制備蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉膜，用5%脫脂乳粉封閉。將一抗按照體積比1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。以TBST（tris buffered saline with Tween）溶液洗滌3 次后加入體積比1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。采用ECL化學發光試劑顯影曝光后洗X光片，利用Alpha Imager Mini凝膠成像系統測定條帶的灰度值，利用灰度值表征條帶的強度。

1.3.4 免疫共沉淀

收集單寧酸處理后細胞，利用裂解緩沖液（50 mmol/L Tris溶液（pH 7.6）、1 mol/L NaCl、1% NP-40、0.5% Triton X-100、5%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑Cocktail）按照干細胞與裂解液1∶3的比例加入裂解液。冰浴30 min，用勻漿器反復勻漿100 次。于15 000×g低溫離心30 min，收集上清液，在上清液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于4 ℃混懸30 min。將混懸液置于磁力收集器上，棄沉淀，收集上清液。將上清液中加入兔源抗TRAF6抗體于4 ℃混懸過夜，次日在混懸液中加入Protein A/G免疫沉淀磁珠于室溫混懸1 h，收集Protein A/G 免疫沉淀磁珠沉淀，并用10 倍體積裂解液反復潤洗沉淀3 次，用SDS-PAGE 1×上樣緩沖液溶解沉淀Protein A/G免疫沉淀磁珠后，進行抗鼠源TRAF6以及抗鼠源Akt的蛋白質印跡檢測。以全細胞裂解液（whole cell lysate，WCE）作為上樣參照，微管蛋白作為內參。

1.3.5 細胞轉染實驗

人膠質瘤U87細胞培養至2×106個/10 cm2細胞培養板的密度后，按照Vigofect轉染試劑說明書進行轉染。轉染24 h后進行單寧酸處理后收集細胞，進行免疫共沉淀以及蛋白質印跡分析。

1.3.6 細胞亞組分分離

單寧酸處理人膠質瘤U87細胞后，細胞亞組分分離參照文獻[12]的方法。利用超速離心機于80 000×g低溫離心2 h后，上清液部分即為細胞胞漿組分；將收集的沉淀繼續用10 倍體積緩沖液重懸后，再次利用超速離心機進行上述操作，獲得的沉淀部分即為質膜部分。

1.4 數據處理

采用SPSS V18.0軟件進行單因素方差分析，同時通過Student’s t檢驗進行組間比較，以P＜0.05為差異顯著。所有實驗結果至少重復3 次，用 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 單寧酸處理抑制人膠質瘤U87細胞的增殖

通過MTS細胞增殖檢測試劑盒研究單寧酸對人膠質瘤U87細胞增殖的影響，結果如圖1所示。

圖1 單寧酸處理對人膠質瘤U87細胞增殖活性的影響Fig. 1 Effect of tannic acid on the proliferation of human glioma U87 cells

由圖1可知，與對照組細胞相比，80 μmol/L單寧酸處理24 h顯著抑制人膠質瘤U87細胞的增殖（P＜0.05），并且細胞增殖抑制率隨著單寧酸處理時間的延長（48～72 h）而升高。80 μmol/L單寧酸處理48、72 h后，發生細胞死亡的比率分別達到27.9%和45.8%，這與Darvin等[10]發現單寧酸能夠抑制乳腺癌細胞增殖的結果相類似。實驗結果表明，單寧酸能夠顯著抑制人膠質瘤細胞的增殖，抗腫瘤效果顯著。

2.2 單寧酸抑制人膠質瘤U87細胞Akt信號通路的磷酸化

為了進一步研究單寧酸對EGFR/Akt信號通路的影響，用80 μmol/L單寧酸處理人膠質瘤U87細胞，并檢測Akt的磷酸化情況。由圖2可知，80 μmol/L單寧酸處理對Akt蛋白的整體表達未見明顯影響，但顯著抑制了Akt絲氨酸473位點的磷酸化（pS473）。一般來講，磷酸化激活的Akt可磷酸化激活其下游2 個效應蛋白靶點：4EBP-1[13]和核糖體S6蛋白[14]的磷酸化。其中，4EBP-1蛋白在不同信號因子的刺激下（例如紫外照射、生長因子、胰島素等）被磷酸化激活而從4EBP上分離下來，結合并促進帽結構依賴性（cap-dependent）mRNA翻譯蛋白的起始[15]；核糖體S6蛋白被磷酸化后，促進5’ TOP（5’terminal oligopyrimidine tract）mRNA翻譯蛋白的起始，進而促進翻譯起始和許多翻譯元件成分如核糖體蛋白、延伸因子等的翻譯，促進腫瘤細胞增殖[16]。通過檢測單寧酸對4EBP-1以及核糖體S6蛋白磷酸化的影響發現，與單寧酸抑制Akt pS473的結果相一致，單寧酸顯著抑制了4EBP-1絲氨酸65（Ser65）位點的磷酸化以及核糖體S6蛋白絲氨酸235和236（Ser235/236）位點的磷酸化。利用凝膠成像系統對Akt pS473的條帶進行灰度掃描，結果如圖3所示。

圖2 單寧酸處理對人膠質瘤U87細胞Akt及其下游效應蛋白磷酸化的影響Fig. 2 Effect of tannic acid on the phosphorylation of Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells

圖3 Western blot灰度掃描定量分析單寧酸對人膠質瘤U87細胞Akt及其下游效應蛋白磷酸化水平的影響Fig. 3 Quantitative analysis of tannic acid on phosphorylated Akt and its downstream effector proteins in human glioma U87 cells by Western blot

由圖3可知，以對照組設定值為100%，發現80 μmol/L單寧酸處理24 h后，對Akt pS473的抑制率達到25.3%；而處理48 h后，抑制率接近50%。通過蛋白條帶灰度掃描計算抑制率發現，當處理72 h時，單寧酸對4EBP-1蛋白pSer65的抑制率達到88.4%，對核糖體S6蛋白pSer235/236的抑制率達到74.7%。綜上所述，表明單寧酸處理抑制Akt信號分子的磷酸化，并抑制了受Akt信號通路調控的4EBP-1和核糖體S6蛋白的磷酸化，抑制蛋白質的翻譯合成，誘導人惡性膠質瘤U87細胞凋亡。

2.3 單寧酸處理抑制TRAF6與Akt蛋白間的相互作用

圖4 單寧酸對人膠質瘤U87細胞Akt與TRAF6間相互作用的影響Fig. 4 Effect of tannic acid on interaction between Akt and TRAF6 in human glioma U87 cells

TRAF6是細胞中介導EGFR/Akt信號通路的重要中間分子，EGFR的過度激活能夠招募TRAF6至細胞膜，TRAF6與Akt結合并通過其自身的RING型泛素連接酶活性催化Akt的泛素化修飾，進而介導泛素依賴的Akt磷酸化激活[17]。基于此，本研究利用TRAF6抗體免疫沉淀TRAF6蛋白，分析單寧酸對TRAF6和Akt間相互作用的影響。由圖4可知，在沉淀的TRAF6蛋白中成功檢測到Akt蛋白，然而與對照組相比，經單寧酸處理的細胞中與TRAF6共沉淀的Akt蛋白的數量明顯減少。實驗結果表明，經單寧酸處理后，細胞中與TRAF6結合的Akt蛋白明顯減少，進而導致依賴TRAF6的Akt磷酸化受到抑制。綜上所述，表明單寧酸對Akt信號通路的抑制作用是通過TRAF6的介導實現的。

2.4 單寧酸抑制TRAF6向細胞質膜的招募

由于TRAF6介導的Akt磷酸化主要發生在細胞質膜[17]，為了研究TRAF6的作用機制，本研究檢測了單寧酸對TRAF6亞細胞定位的影響。由圖5、6可知，單寧酸對人惡性膠質瘤U87細胞胞漿中TRAF6蛋白量影響不大，卻顯著減少了細胞質膜上的TRAF6蛋白的數量。通過蛋白條帶灰度掃描發現，單寧酸處理24、48、72 h后，質膜上TRAF6蛋白分別減少了43.7%、50.0%和76.7%。實驗結果表明，單寧酸處理抑制TRAF6蛋白向細胞質膜的招募。結合圖4中單寧酸減少了與TRAF6互作的Akt蛋白的數量，可推測單寧酸通過降低TRAF6向細胞質膜的招募導致與TRAF6結合的Akt蛋白減少，進而抑制Akt的磷酸化。

圖5 單寧酸對人膠質瘤U87細胞TRAF6亞細胞定位的影響Fig. 5 Effect of tannic acid on the subcellular localization of TRAF6 in human glioma U87 cells

圖6 Western blot灰度掃描定量分析單寧酸對人膠質瘤U87細胞TRAF6亞細胞定位的影響Fig. 6 Quantitative analysis of tannic acid on TRAF6 subcellular localization in human glioma U87 cells by Western blot

2.5 單寧酸抑制TRAF6向細胞質膜的招募與EGFR的磷酸化的相關性

EGFR是一種糖蛋白，主要由3 個部分組成：第一部分是胞外配體結合結構域，包括N端621 個氨基酸殘基，這些殘基富含半胱氨酸，并形成多對二硫鍵，其上結合有糖基，是表皮生長因子結合的位點；第二部分是跨膜結構域，由23 個氨基酸殘基組成；第三部分是胞內激酶結構域，由542 個氨基酸殘基組成，含有酪氨酸激酶和幾個酪氨酸磷酸化的位點[18]。為了研究單寧酸調控TRAF6質膜招募是否與EGFR的磷酸化有關，在人膠質瘤U87細胞中表達EGFR組成型激活突變體EGFR vIII。EGFR vIII突變體中編碼EGFR胞外區的第2～7位間外顯子丟失，導致EGFR蛋白胞外配體響應區缺失，形成分子質量為155 kDa左右的突變蛋白[19]。與野生型EGFR的激活受胞外配體，例如表皮生長因子（epidernal growth factor，EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等的激活不同，EGFR vIII能夠在沒有配體存在的條件下組成型激活[20]。因此，在人膠質瘤U87細胞中利用pcDNA3質粒載體異位表達EGFR vIII突變體，轉染24 h后檢測EGFRvⅢ突變體的磷酸化，結果如圖7所示。

圖7 單寧酸對過表達EGFRvⅢ突變體細胞中TRAF6細胞質膜招募的影響Fig. 7 Effect of tannic acid on TRAF6 recruitment to plasma membrane after ectopic expression of EGFRv III mutant in human glioma U87 cells

由圖7可知，利用EGFR抗體成功檢測到EGFR vⅢ突變體蛋白的表達，其分子質量略小于野生型EGFR蛋白的分子質量。進一步檢測EGFR的磷酸化（Y1068）發現在沒有任何配體（EGF）存在的條件下，檢測到EGFR vⅢ突變體的組成型激活。但是，與對照組相比，單寧酸處理48 h后雖然對野生型EGFR的磷酸化有抑制作用，但是對EGFR vIII突變體的磷酸化未表現抑制作用。實驗結果表明，單寧酸對EGFR磷酸化的抑制作用需要EGFR胞外區第2～7位外顯子間的區域，該區域的丟失導致EGFR的磷酸化對單寧酸不敏感，該區域是單寧酸調控EGFR的關鍵區。同時，在EGFR vIII突變體過表達的細胞中，Akt和TRAF6招募至細胞質膜上的數量未受到單寧酸的影響，即EGFR vIII磷酸化激活不受單寧酸影響后，招募至細胞質膜上TRAF6和Akt的數量也不受單寧酸影響，表明單寧酸通過調控EGFR磷酸化抑制TRAF6向細胞質膜的招募，而質膜TRAF6的減少介導了Akt磷酸化信號的抑制，誘導細胞發生凋亡。綜上所述，EGFR可能是單寧酸的受體，單寧酸通過EGFR實現跨膜信號傳遞，調控腫瘤細胞的增殖和細胞周期，誘導腫瘤細胞發生凋亡，發揮抗腫瘤功效。

3 討 論

TRAF6是腫瘤壞死因子超家族（tumor necrosis factor，TNF）和Toll樣/白細胞介素-1受體（Toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接頭分子[21]，在天然免疫和獲得性免疫中發揮多重的作用[22]。同時TRAF6是細胞中介導EGFR/Akt信號通路的重要中間分子[17]。TRAF6具有泛素連接酶活性[23]，其可泛素化修飾Akt進而介導泛素途徑依賴的Akt磷酸化激活[24]。TRAF6通常作為一個開關，決定在細胞內開啟何種信號[17]。本研究結果表明，細胞經單寧酸處理后，招募至質膜上的TRAF6蛋白減少，進而介導了單寧酸對EGFR/Akt信號通路的抑制作用，抑制腫瘤細胞的增殖。其中，質膜招募TRAF6蛋白的減少可以通過兩個方面抑制Akt的磷酸化激活：一方面與TRAF6直接相互作用的Akt蛋白數量減少，該推論已經被圖4的結果證實，導致Akt磷酸化被抑制；另一方面，TRAF6是激活轉化生長因子激酶1（transform growth factor kinase，TAK1）的關鍵蛋白[25]，例如，轉化生長因子（transform growth factor，TGF）通過TRAF6激活TAK1[26]，而TAK1是磷酸化Akt的蛋白激酶[27]。因此，單寧酸抑制質膜TRAF6的招募，進而抑制TAK1的激活，導致Akt磷酸化抑制的可能性也不能排除。

單寧酸對EGFR磷酸化的調節作用依賴于EGFR胞外區第2～7位外顯子所在片段，即從第81～290位氨基酸殘基間的片段，該片段恰好為EGF結合區[19]，推測單寧酸可能通過和EGF競爭與EGFR結合，發揮其抗腫瘤作用。另外，單寧酸與EGFR結合后，可能誘導EGFR或其二聚體發生特定的構象變化，使部分位點的磷酸化受到空間限制，不易于發生磷酸化激活，但對有的位點影響不大，其原因還需要進一步深入研究。因為單寧酸屬于植物多酚類物質[28]，分子質量偏大，易溶于水，其化學結構導致單寧酸很難穿過細胞膜進入細胞內部，因此，單寧酸通過作用于EGFR胞外區，抑制腫瘤細胞中異常激活的EGFR磷酸化，進而實現單寧酸信號的跨膜傳遞。已有研究發現，EGFR是單寧酸的受體蛋白[10]，單寧酸對腫瘤細胞增殖的抑制作用主要通過調控EGFR進行，而EGFR的磷酸化位點有多個，每個位點的磷酸化都與相應的信號轉導通路相偶聯[29]。本實驗室前期研究中發現單寧酸對Janus激酶（Janus kinase，Jak）/STAT3信號通路也存在抑制作用。結合本研究中單寧酸通過抑制TRAF6向質膜招募抑制EGFR/Akt信號通路，推測單寧酸對腫瘤細胞增殖的抑制作用與EGFR的功能類似，可能存在多條信號通路的共同作用。是否除了這2 條信號通路，單寧酸對其他信號轉導途徑，例如絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）以及核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號途徑，是否存在調控作用還需要進一步研究。進一步比較不同信號通路在單寧酸抑制腫瘤細胞增殖中的作用對于闡述單寧酸的功能是非常重要的。

綜上所述，食品中的單寧酸能夠通過TRAF6介導抑制腫瘤細胞中過度激活的EGFR/Akt信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖，為新型抗癌食品甚至藥物的開發提供了理論基礎。這與很多研究人員利用TRAF6作為靶點開發新的對抗晚期癌癥的策略相類似，例如乳腺癌和前列腺癌[30]，為富含單寧的食物或者在藥物中添加單寧進行腫瘤的預防和治療提供理論依據。

參考文獻：

[1] RINGEL M D, HAYRE N, SAITO J, et al. Overexpression and overactivation of Akt in thyroid carcinoma[J]. Cancer Research, 2001,61(16): 6105-6111.

[2] NISHIMURA Y, TAKIGUCHI S, ITO S, et al. EGF stimulated AKT activation is mediated by EGFR recycling via an early endocytic pathway in a gefitinibresistant human lung cancer cell line[J]. International Journal of Oncology, 2015, 46(4): 1721-1729.DOI:10.3892/ijo.2015.2871.

[3] BISWAS R, MONDAL A, AHN J C. Deregulation of EGFR/PI3K and activation of PTEN by photodynamic therapy combined with carboplatin in human anaplastic thyroid cancer cells and xenograft tumors in nude mice[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B Biology, 2015, 148: 118-127. DOI:10.1016/j.jphotobiol.2015.03.024.

[4] DUAN H, QU L, SHOU C. Activation of EGFR-PI3K-AKT signaling is required for Mycoplasma hyorhinis-promoted gastric cancer cell migration[J]. Cancer Cell International, 2014, 14(1): 135-143.DOI:10.1186/s12935-014-0135-3.

[5] PARK J H, DARVIN P, LIM E J, et al. Hwanggeumchal sorghum induces cell cycle arrest, and suppresses tumor growth and metastasis through Jak2/STAT pathways in breast cancer xenografts[J]. PLoS ONE, 2012, 7(7): e40531. DOI:10.1371/journal.pone.0040531.

[6] TOMAS-BARBERAN F A, SELMA M V, ESPIN J C. Interactions of gut microbiota with dietary polyphenols and consequences to human health[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care,2016, 19(6): 471-476. DOI:10.1097/MCO.0000000000000314.

[7] 張小利, 王慧清, 張月巧, 等. 植物多酚通過Wnt/β-catenin信號通路抗腫瘤作用研究進展[J]. 食品科學, 2015, 36(5): 227-232.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505042.

[8] TALEB H, MADDOCKS S E, MORRIS R K, et al. The antibacterial activity of date syrup polyphenols against S. aureus and E. coli[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 198-206. DOI:10.3389/fmicb.2016.00198.

[9] SHIN S Y, YOON H, AHN S, et al. Structural properties of polyphenols causing cell cycle arrest at G1 phase in HCT116 human colorectal cancer cell lines[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(8):16970-16985. DOI:10.3390/ijms140816970.

[10] DARVIN P, JOUNG Y H, KANG D Y, et al. Tannic acid inhibits EGFR/STAT1/3 and enhances p38/STAT1 signalling axis in breast cancer cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2017, 21(4): 720-734. DOI:10.1111/jcmm.13015.

[11] RUAN H, ZHANG Z, TIAN L, et al. The Salmonella effector SopB prevents ROS-induced apoptosis of epithelial cells by retarding TRAF6 recruitment to mitochondria[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 478(2): 618-623. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.116.

[12] WEST A P, BRODSKY I E, RAHNER C, et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS[J]. Nature,2011, 472: 476-480. DOI:10.1038/nature09973.

[13] CAI N, DAI S D, LIU N N, et al. PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors in proliferation of retinal pigment epithelial cells[J]. International Journal of Ophthalmology, 2012, 5(6): 675-680.DOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2012.06.05.

[14] COSTA C, PEREIRA S, LIMA L, et al. Abnormal protein glycosylation and activated PI3K/Akt/mTOR pathway: role in bladder cancer prognosis and targeted therapeutics[J]. PLoS ONE, 2015, 10(11): e0141253.DOI:10.1371/journal.pone.0141253.

[15] DAVERI E, MAELLARO E, VALACCHI G, et al. Inhibitions of mTORC1 and 4EBP-1 are key events orchestrated by Rottlerin in SK-Mel-28 cell killing[J]. Cancer Letters, 2016, 380(1): 106-113.DOI:10.1016/j.canlet.2016.06.018.

[16] JASTRZEBAKI K, HANNAN K M, TCHOUBRIEVA E B,et al. Coordinate regulation of ribosome biogenesis and function by the ribosomal protein S6 kinase, a key mediator of mTOR function[J].Growth Factors, 2007, 25(4): 209-226. DOI:10.1080/08977190701779101.

[17] YANG W L, WANG J, CHAN C H, et al. The E3 ligase TRAF6 regulates Akt ubiquitination and activation[J]. Science, 2009, 325: 1134-1138.DOI:10.1126/science.

[18] PRIGENT S A, LEMOINE N R. The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands[J]. Progress in Growth Factor Research, 1992, 4(1): 1-24. DOI:10.1016/0955-2235(92)90002Y.

[19] NISHIKAWA R, JI X D, HARMON R C, et al. A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(16): 7727-7731.

[20] LIU Z, HAN L, DONG Y, et al. EGFRvIII/integrin beta3 interaction in hypoxic and vitronectinenriching microenvironment promote GBM progression and metastasis[J]. Oncotarget, 2016, 7(4): 4680-4694.DOI:10.18632/oncotarget.6730.

[21] JIAO S, ZHANG Z, LI C, et al. The kinase MST4 limits inflammatory responses through direct phosphorylation of the adaptor TRAF6[J].Nature Immunology, 2015, 16(3): 246-257. DOI:10.1038/ni.3097.

[22] WALSH MC, LEE J, CHOI Y. Tumor necrosis factor receptorassociated factor 6 (TRAF6) regulation of development, function, and homeostasis of the immune system[J]. Immunological Reviews, 2015,266(1): 72-92. DOI:10.1111/imr.12302.

[23] JI Y X, ZHANG P, ZHANG X J, et al. The ubiquitin E3 ligase TRAF6 exacerbates pathological cardiac hypertrophy via TAK1-dependent signalling[J]. Nature Communications, 2016, 7: 11267. DOI:10.1038/ncomms11267.

[24] ZHANG L, WANG Y, XIAO F, et al. CKIP-1 regulates macrophage proliferation by inhibiting TRAF6-mediated Akt activation[J]. Cell Research, 2014, 24(6): 742-761. DOI:10.1038/cr.2014.53.

[25] LEE H J, JANG S H, KIM H, et al. PINK1 stimulates interleukin-1betamediated inflammatory signaling via the positive regulation of TRAF6 and TAK1[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2012, 69(19): 3301-3315. DOI:10.1007/s00018-012-1004-7.

[26] RAJAGOPALAN S, LEE E C, DUPRIE M L, et al. TNFR-associated factor 6 and TGF-beta-activated kinase 1 control signals for a senescence response by an endosomal NK cell receptor[J]. Journal of Immunology,2014, 192(2): 714-721. DOI:10.4049/jimmunol.1302384.

[27] XIAO F, WANG H, FU X, et al. TRAF6 promotes myogenic differentiation via the TAK1/p38 mitogen-activated protein kinase and Akt pathways[J]. PLoS ONE, 2012, 7(4): e34081. DOI:10.1371/journal.pone.0034081.

[28] JEONG B, JEONG E S, MALAZARTE J M, et al. Physiological and molecular response of prorocentrum minimum to tannic acid: an experimental study to evaluate the feasibility of using tannic acid in controling the red tide in a eutrophic coastal water[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2016, 13(5): 503-516. DOI:10.3390/ijerph13050503.

[29] WHITE H A, JIN Y, CHICOINE L G, et al. Hypoxic proliferation requires EGFR-mediated ERK activation in human pulmonary microvascular endothelial cells[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology, 2017, 312(5): L649-L656.DOI:10.1152/ajplung.00267.2016.

[30] HE Z, HUANG C, LIN G, et al. siRNA-induced TRAF6 knockdown promotes the apoptosis and inhibits the invasion of human lung cancer SPC-A1 cells[J]. Oncology Reports, 2016, 35(4): 1933-1940.DOI:10.3892/or.2016.4602.