貨架期冷藏過程中鱔魚肉理化指標及蛋白質變化規律

鄭 紅，蘇現波，馬 良,3，張曉潔，馬明思，孫 藝，張宇昊,3,*

黃鱔（Monopterus albus），俗稱鱔魚、羅魚、長魚、無鱗公子，是典型的高蛋白、低脂肪經濟魚類，具有味道鮮美、營養價值高等優點，深受消費者喜愛[1]。據統計，2015年全國總產量達36.8萬 t，較2014年增長了2.67%[2-3]。目前很多超市都有冷藏調制鱔魚肉制品流通售賣，很多餐飲店也直接買入鱔魚肉冷藏待加工。眾所周知，魚肉宰殺后，在微生物和內源酶的作用下易發生劣變，導致其食用價值降低[4]。因此，研究鱔魚肉在貨架期貯藏過程中的品質變化規律具有重要意義。

蛋白質是魚類肌肉組織的重要組成部分，決定魚類肌肉質量的好壞，其在貯藏過程中的降解、聚集或變性都會引起魚肉品質的改變[5]。任麗娜[6]通過研究白鰱魚肉在-18 ℃和-50 ℃下凍藏過程中的品質、肌原纖維蛋白理化特性和結構的變化，發現了蛋白變性是引起魚肉營養缺失、功能性質下降以及結構改變等的重要原因。Lu Han等[7]通過測定4 ℃和-3 ℃條件下的蛋白質氧化參數、持水性（water-holding capacity，WHC）和質構特性等，發現蛋白質氧化是導致鳙魚WHC和質構變化的主要因素。Masniyom[8]通過加入延緩微生物生長及酶活性的物質，發現可明顯抑制魚肉蛋白質降解等現象，從而延長魚類產品的保質期。

近年來，對鱔魚的研究主要集中在生物胺和保鮮方面。尤娟等[9]發現貯藏溫度和時間對鱔魚肉鮮度和生物胺含量成正相關，為鱔魚肉的鮮度控制、微生物生長及貨架期的確定提供了一定的理論依據。呂凱波[10]以生鮮鱔片為原料，研究了貯藏溫度和氣調包裝方式對貯藏過程中鱔片品質變化和菌相生長的影響，結果顯示溫度越高，鱔魚貨架期越短，腐敗菌含量越高，且包裝方式對冰溫貯藏鱔片的品質和菌相有明顯影響。但目前關于鱔魚肉貨架期冷藏過程中理化指標以及其中蛋白質變化方面研究鮮見報道。近年來，越來越多的超市出現了鱔魚冷藏調制食品，該類產品都是建議盡快食用，未明確標注保質期。其原因之一在于鱔魚貨架期冷藏過程中理化指標及其蛋白質變化方面研究數據缺失。

本實驗以新鮮鱔魚為原料，研究貨架期內鱔魚肉理化指標和蛋白質變化規律，旨在從蛋白質變化角度探討鱔魚肉品質變化機理，研究其蛋白質結構特征的變化規律，為冷藏調制鱔魚制品的貯存、保質及其他新鮮鱔魚產品研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱔魚肉，采購于北碚區天生菜市場，體長25～35 cm，體質量60～70 g。

鹽酸、氯化鈉、硫酸、硫化鈉、氫氧化鈉、正丙醇、異丙醇、石油醚（30～60 ℃）、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、無水乙醇、高氯酸、溴化鉀、磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀氯仿、尿素 成都市科龍化工試劑廠；羥脯氨酸 上海楷洋生物技術有限公司；ATP等標準品 美國Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 天津市鑫源化工有限公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA） 上海科豐實業有限公司；過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考馬斯亮藍R-250 美國Bio Basic公司；30 g/100 mL的丙烯酰胺工作液 北京索萊寶科技有限公司；標準蛋白（分子質量10～200 kDa） 賽默飛世爾科技公司。其中Tris、ATP等標準品、考馬斯亮藍R-250、30%丙烯酰胺為優級純，溴化鉀為光譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；QL 901 Vortex旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UV-2450紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；PHS-25型數顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠；4-6型馬弗爐、8002型溫控水浴鍋北京永光明醫療儀器廠；DGG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；UltraScan PRO測色儀 美國HunterLab公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海將任實驗設備有限公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；Spectrun100傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀美國Perkin Elmer公司；Power PacTM基礎電泳儀美國Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝膠成像系統 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 魚肉處理

鮮活鱔魚去頭、骨和內臟，純水洗凈后，置于（4±1）℃條件下保鮮貯藏。

1.3.2 TVB-N含量的測定

揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量參照SC/T 3032—2007《水產品中揮發性鹽基氮的測定》半微量定氮法測定[11]。

1.3.3 K值的測定

K值參照SC/T 3048—2014《魚類鮮度指標K值的測定高效液相色譜法》測定[12]。

1.3.4 TBARS值的測定

硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值參照Vyncke[13]的方法測定。取10 g鱔魚肉于燒杯中，加入25 mL水，勻漿，再加入25 mL、體積分數7.5% TCA溶液，充分攪拌均勻，靜置30 min后過濾。準確移取上述濾液5 mL于試管中，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，于80 ℃水浴加熱40 min，冷卻至室溫，加入5 mL氯仿，搖勻，靜置，分層，分別在532 nm和600 nm波長處測定吸光度。結果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量計，TBARS值的單位為mg MDA/kg。

1.3.5 pH值的測定

參照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》規定的方法[14]。準確稱取10.0 g魚肉置于燒杯，加入50 mL預先煮沸冷卻的蒸餾水，勻漿，靜置30 min，用酸度計直接測定pH值。

1.3.6 持水率的測定

參照劉大松等[15]14的方法進行測定。稱取一定質量魚肉于離心管中，記錄離心管和魚肉的質量（m1/g），在離心管中加入幾片濾紙，4 ℃、210×g離心15 min。取出濾紙，記錄離心管和魚肉的質量（m2/g）。持水率按式（1）進行計算。

式中：w為鱔魚的水分質量分數/%；m為鱔魚的質量/g。

1.3.7 色澤的測定

取出鱔魚，剔出骨刺，取其脊背處肌肉，切成約30 mm長度，在空氣中放置20 min后，采用LAB色差儀測定鱔魚肉顏色變化，其中，L*表示亮度，a*表示紅（+）綠（-），b*表示黃（+）藍（-）。

1.3.8 TCA-可溶性氮含量的測定

參照Benjakul等[16]的方法并略作修改。3.0 g魚肉中加入27 mL、體積分數5% TCA溶液，均質2 min，勻漿液在冰浴中放置1 h后，5 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液。采用Lowry法測定TCA-可溶性氮含量。

1.3.9 電泳分析

參照楊暉等[17]的方法并略作修改。稱50 mg魚肉溶解于5 mL蛋白變性劑中，振蕩均勻，于（4±1）℃條件下貯存。離心5 min取上清液，按照4∶1（V/V）與上樣緩沖液進行混合，沸水浴5 min，冷卻后上樣，上樣量為15 μL（Marker上樣量為10 μL）。其中分離膠質量分數為10%，濃縮膠質量分數為5%。15 mA恒流電泳，待樣品跑到分離膠后，電流調至25 mA，電泳時間約30 min。電泳結束后用考馬斯亮藍R-250進行染色，2 h后用脫色液于30 ℃條件下振蕩脫色，每30 min換一次脫色液，直至背景藍色脫凈后用凝膠成像系統拍攝電泳圖譜，再用Gene Tools數據處理軟件進行分析。

1.3.10 化學作用力測定

參照Gómez-Guillén等[18]方法。分別取2.0 g魚肉分別與10 mL A、B、C、D、E 5 種溶液混合。A為0.05 mol/L NaCl，B為0.6 mol/L NaCl，C為0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，D為0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，E為0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巰基乙醇。混合后均質，于4 ℃靜置1 h，然后10 000 r/min離心15 min，用Lowry法測定上清液中蛋白質的含量。離子鍵的貢獻以溶解于A與B溶液中蛋白質含量之差來表示；氫鍵的貢獻以溶解于B與C溶液中蛋白質含量之差來表示；疏水性相互作用的貢獻以溶解于C與D溶液中蛋白質含量之差來表示；二硫鍵的貢獻以溶解于D與E溶液中蛋白質含量之差來表示。

1.3.11 紅外光譜分析

將絞碎的魚肉真空冷凍干燥備用。樣品與KBr（1∶100，m/m）混合后研磨，45 ℃下烘干后壓片，用FTIR進行檢測。室內溫度為25 ℃，掃描范圍400～4 000 cm-1；掃描次數64 次；分辨率4 cm-1。

1.4 數據分析

數據分析處理采用Microsoft Excel 2013和Origin8.6軟件。每次實驗設置3 個平行，數據以 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 鱔魚在冷藏過程中的生化性質變化

TVB-N含量可以反映蛋白質的分解程度，常作為評價魚肉初期腐敗的重要指標。由圖1可知，TVB-N含量隨貯藏時間延長而增加；說明在微生物和酶的作用下，蛋白質分解產生胺類及堿性含氮物，使得TVB-N含量增加[19]。在第6天，鱔魚的TVB-N含量增加幅度明顯升高，已經超過我國淡水魚衛生標準GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》（TVB-N含量≤20 mg/100 g）[20]。周嬌嬌等[21]實驗結果表明，鱔魚在冷藏后期TVB-N含量迅速增加，新鮮度顯著下降，與本實驗結果基本一致。

圖1 冷藏過程中鱔魚肉TVB-N含量、TBARS值、K值的變化Fig. 1 Changes in TVB-N content, TBARS and K value of Monopterus albus during cold storage

K值能反映魚體死后降解反應進行的程度，適合魚類早期鮮度的評定。由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，K值不斷增加，在第5天，K值大于40%。da Costa Silva Andrade等[22]研究發現魚肉的K值小于20%時適合生吃，K值大于40%即已初期腐敗。因此，從K值的角度分析，鱔魚的貨架期為4 d。

TBARS值可以反映魚肉的脂質氧化情況，是評價肉類和水產品品質變化的良好指標。如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，TBARS值逐漸增加；表明脂肪氧化產物MDA增多，氧化程度增加。第6天，TBARS值大于1.0 mg MDA/kg，超過Yu Dawei等[23]規定的可接受限度（TBARS值≤1.0 mg MDA/kg）。

綜合各項評價指標，確定鱔魚在冷藏條件（4 ℃）下的貨架期為4 d。

2.2 鱔魚在冷藏過程中的物理性質變化

2.2.1 鱔魚在冷藏過程中的pH值變化

圖2 冷藏過程中鱔魚肉pH值的變化Fig. 2 Change in pH of Monopterus albus during cold storage

由圖2可知，冷藏過程中，隨著冷藏時間的延長，魚肉的pH值呈先降低后上升趨勢。冷藏初期，糖原和ATP等物質降解，使得pH值下降；隨著貯藏時間的延長，魚體內蛋白質等含氮物質不斷分解，生成氨基酸及一些含氮的小分子等堿性物質，導致pH值上升，符合動物死后肉類僵直與解僵規律[15]17-18[24]。

2.2.2 鱔魚在冷藏過程中的持水率變化

圖3 冷藏過程中鱔魚肉持水率的變化Fig. 3 Change in water-holding capacity of Monopterus albus during cold storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，鱔魚的持水率呈現下降趨勢。魚肉持水力的變化與其質構品質密切相關；持水力降低，致使肉的嫩度降低，肉質變硬，表明魚肉質構品質有所下降。此外，水分滲出還會導致可溶性成分隨之損失，造成肌肉營養品質下降[25]。貯藏期間鱔魚持水力下降，可能和貯藏過程中蛋白質降解有關。

2.2.3 鱔魚在冷藏過程中的色澤變化

圖4 冷藏過程中鱔魚肉色澤的變化Fig. 4 Change in color of Monopterus albus during cold storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，魚肉的L*值和a*值整體呈下降趨勢，b*值則呈現先下降后上升的趨勢。新鮮鱔魚肉色澤鮮亮，L*值下降說明隨著貯藏時間的延長，鱔魚肉的光澤度降低；主要是由于肌肉組織間自由水含量降低，導致魚肉表面光線反射率下降，顏色逐漸變暗。a*值下降表明魚肉紅度值降低，這可能是由于脂質氧化產生大量羥自由基、H2O2及一些氧化產物（如MDA等），這些物質會促使肌紅蛋白中的Fe2+氧化，加快肉色的褐變[26]。b*值的變化也與肌紅蛋白的含量有關。Lan Yang等[27]研究證明，TBARS的增加與L*和a*值的降低表明脂質的氧化會加速肌紅蛋白的氧化，與本實驗結果基本一致。

2.3 鱔魚在冷藏過程中的蛋白質降解

由圖5A可知，在冷藏過程中，TCA-可溶性氮含量隨貯藏時間延長而增加；說明魚肉蛋白質在內源酶及微生物作用下發生了降解。由圖5B可知，鱔魚肉的蛋白條帶主要包括肌球蛋白的重鏈和肌動蛋白。鱔魚肉蛋白圖譜中，肌球蛋白的重鏈和肌動蛋白的條帶逐漸變淡，說明肌球蛋白和肌動蛋白發生了降解，此外，膠原蛋白的條帶也逐漸變淡，說明膠原蛋白也可能發生了部分降解。在電泳圖中小分子條帶未出現明顯變化，可能是因為蛋白降解組分的分子質量較低未被電泳檢測出[28]。

圖5 冷藏過程中鱔魚肉TCA-可溶性氮含量（A）和全蛋白的SDS-PAGE圖（B）Fig. 5 Change in TCA-soluble nitrogen content (A) and SDS-PAGE analysis of total proteins (B) in Monopterus albus during cold storage

2.4 鱔魚在冷藏過程中的化學作用力變化

圖6 冷藏過程中鱔魚肉化學作用力的變化Fig. 6 Change in chemical forces of proteins in Monopterus albus during cold storage

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵是維持蛋白質三維網絡結構的主要作用力。由圖6可知，貨架期內（4 d）隨著貯藏時間的延長，離子鍵和氫鍵總體呈下降趨勢，二硫鍵和疏水作用呈現逐漸增加趨勢，這些價鍵的變化可以反映出蛋白質原有的結構發生變化。冷藏期間，埋藏于分子內部的巰基氧化成二硫鍵，二硫鍵的形成引起肌球蛋白重鏈的聚合，進而降低肌原纖維蛋白的鹽溶性，這可能導致離子鍵被破壞，與Benjakul等[29]的實驗結果一致。而前期蛋白質的去折疊及疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露，造成疏水相互作用增加，在貯藏第5天，離子鍵和二硫鍵保持原有變化趨勢，氫鍵有所增加，而疏水作用有所下降。這可能是因為后期鱔魚肉在內源酶及微生物作用下，蛋白降解達到一定程度，肽段的構象發生變化，導致蛋白之間氫鍵和疏水作用模式發生改變[30-31]。總體而言，隨著價鍵的破壞，蛋白原有的構象發生改變，結構變松散，蛋白質無序程度增加。

2.5 冷藏過程中鱔魚肉的紅外光譜分析

圖7 冷藏過程中鱔魚肉的FTIR圖譜Fig. 7 FTIR spectra of Monopterus albus during cold storage

表1 冷藏過程中鱔魚肉紅外光譜特征峰吸收波長Table 1 Absorption wavelength of infrared (IR) characteristic peaks of Monopterus albus during cold storage

酰胺A帶（3 400～3 440 cm-1）是N-H或O-H伸縮振動的吸收峰，當含有N—H基團的分子肽段參與氫鍵形成時，N—H伸縮振動向低波數移動[32]；酰胺I帶（1600～1700 cm-1）表示C＝O伸縮振動，其振動頻率主要取決于C＝O和N-H之間的氫鍵性質[33]，通過二者可以綜合判斷肽鏈間氫鍵的變化情況。由表1可知，1～4 d，酰胺I帶的吸收峰向高波數移動，酰胺A帶從第2天開始吸收峰也向高波數移動，總體說明前4 d冷藏過程中魚肉蛋白質間的氫鍵遭到破壞。4～5 d，酰胺A帶和酰胺I帶的吸收峰向低波數移動，說明有C＝O基團或N-H基團的分子肽段參與氫鍵形成。與前面氫鍵變化趨勢一致。

表2 冷藏過程中鱔魚肉的蛋白二級結構含量Table 2 Changes in secondary structure contents of proteins in Monopterus albus during cold storage

對酰胺I帶的計算結果進行去卷積和高斯擬合，得到各二級結構含量變化情況。由表2可知，蛋白二級結構含量發生變化，結合價鍵分析表明離子鍵和氫鍵可能是貯藏初期維系鱔魚蛋白二級結構的主要作用力，二者的破壞導致蛋白構象改變。

冷藏初期主要是β-組分間的轉化，α-螺旋和無規卷曲總體變化趨勢不明顯，冷藏后期，β-折疊和β-轉角轉化為無規卷曲和α-螺旋。1～4 d，維持蛋白空間結構的氫鍵斷裂，蛋白質伸展，同時疏水殘基暴露，疏水相互作用增加，巰基在冷藏過程中被氧化成二硫鍵，使得多肽特有的折疊結構發生改變，引起β-組分間的轉化。4～5 d，蛋白質變性導致網絡結構破壞，結構變松散，蛋白質無序程度增加，導致β-折疊和β-轉角轉化為α-螺旋和無規卷曲。同時蛋白質分子被酶解生成小分子物質，α-螺旋含量增加的原因可能是降解產生的小分子組分相互作用所致。

3 結 論

首先明確了4 ℃條件下鱔魚貨架期是4 d，且隨著冷藏時間的延長，鱔魚的品質逐漸劣化。

通過TCA-可溶性氮含量和SDS-PAGE分析表明，貨架期內隨著冷藏時間的延長，肌球蛋白和肌動蛋白逐漸發生降解。

價鍵分析表明冷藏貨架期內離子鍵和氫鍵呈減少的趨勢，二硫鍵和疏水作用呈現逐漸增加的趨勢。FTIR分析結果表明冷藏貨架期內，酰胺A帶吸收峰總體向高波數移動，這與氫鍵變化趨勢一致。酰胺I帶曲線擬合結果表明，冷藏前期主要是β-組分間的相互轉化，后期則由β-組分向α-螺旋和無規卷曲轉化，蛋白質無序程度增加，蛋白質構象發生改變。綜上所述，貨架期冷藏過程中氫鍵和離子鍵可能是貯藏初期維系鱔魚蛋白二級結構的主要作用力，二者的改變會導致蛋白空間結構發生相應變化，使得鱔魚肉理化性質的變化，最終導致鱔魚肉品質持續下降。

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