副干酪乳桿菌FX-6產抗菌肽粗提物對荔枝貯藏品質的影響

彭 勃，馮孔龍，苗建銀,2,3，陳運嬌,3，陳飛龍,4，曹 庸,3,*

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是亞熱帶常綠植物無患子科（Sapindaceae）荔枝屬植物，原產于我國華南亞熱帶地區，具有廣泛的市場價值[1]。荔枝果實在采摘前后都容易遭受病原菌的入侵，主要腐敗菌包括霜疫霉、黑曲霉、黃曲霉、青霉等，此外一些酵母菌和細菌也會在果皮表面繁殖并深入果內，使果肉變酸、腐爛[2]。另外，荔枝采后的生理代謝旺盛，極易發生果皮褐變、水分流失和果肉營養成分降解等問題，十分不耐貯存。目前，荔枝采后病原菌的防治仍然主要依靠化學藥物[3]，如廣譜低毒的殺菌劑等。然而這類殺菌劑容易在果皮上殘留，甚至通過果皮滲入果肉，對人體健康造成危害。隨著社會生活水平的提高，人們對食品品質要求越來越高，天然防腐劑的開發和應用受到廣泛關注。因此，開發更為安全有效的防腐保鮮劑是目前荔枝保鮮技術的研究熱點。

抗菌肽是一類天然來源的具有抗菌活性的多肽類物質，對各種細菌和真菌均具有抑制作用[4]，但其抗菌機制有異于傳統抗生素[5-6]，可以有效抑制對抗生素產生耐藥性的細菌[7]，還具有殺菌速度快、不易被蛋白酶水解等特點[8]。因此，抗菌肽目前已被廣泛應用于食品保鮮等領域。

在前期研究中[9-11]，本實驗室從由西藏開菲爾中篩選得到了一株新菌株——副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）FX-6，通過該菌株發酵獲得的發酵產物，經初步分離純化及冷凍干燥后得到了抗菌肽粗提物。經分離鑒定，該抗菌肽粗提物中主要作用物質包括具有廣譜性、高效性的天然抗菌肽F1、F3以及少量乳酸，對多種常見的食源性致病菌（包括荔枝采后的主要致病菌：黑曲霉、黑根霉、黃曲霉、灰綠青霉等）均有較強的抑制作用。目前已發現該抗菌肽粗提物能夠有效抑制牛乳、饅頭、冷鮮肉、鮮蝦等食品在貯藏過程中的腐敗變質[11-13]，具有潛在的應用前景。

本研究通過離體實驗研究抗菌肽粗提物對荔枝霜疫霉菌（荔枝主要腐敗菌之一）的抑制作用；選取‘桂味’荔枝為研究對象，通過檢測用抗菌肽粗提物處理后的不同貯藏時期荔枝果實感官指標和理化指標，探討常溫條件下抗菌肽粗提物對荔枝貯藏品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗菌肽粗提物由廣東省天然活性物工程技術研究中心實驗室自制[13]；‘桂味’荔枝采摘于潮州市果樹研究所；發酵菌為副干酪乳桿菌FX-6，從西藏開菲爾中分離得到，現保存于華南農業大學食品學院；供試菌株為荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchi），由華南農業大學資源環境學院殺菌劑研究室分離和保存。

施保克咪鮮胺（以下簡稱施保克） 江門市大光明農化新會有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 武漢博士德生物工程有限公司；2,6-二氯靛酚 上海源葉生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸 天津市大茂化學試劑廠；氫氧化鈉 上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

PL203型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1750型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；DH500BII型電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；EnSpire2300型多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司；DC-P3型全自動測色色差儀 北京市興光測定儀器有限公司；PHS-3C型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；手持式折光儀 衢州艾普計量儀器有限公司；90plus型Zeta電位測定儀 美國布魯克海文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落培養及抑菌率的測定

參照陳興龍等[14]的方法并修改，分別向培養皿中倒入含有抗菌肽粗提物0.0（對照）、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL的PDA培養基20 mL，待培養基凝固后，在培養基中心放置一個直徑為8 mm的荔枝霜疫霉菌菌餅，使長有菌絲的一面與培養基相接觸，于25 ℃條件下培養72 h，用十字交叉法測量不同處理組的菌落直徑，抑菌率、菌落凈生長直徑計算分別如式（1）、（2）所示。

1.3.2 抗菌肽粗提物對采后荔枝保鮮作用的評價

1.3.2.1 分組及處理

選取大小均一、顏色均勻、無病蟲害的荔枝果實，從果蒂處剪斷后隨機分組。將各組荔枝分別用蒸餾水（對照組）、0.5 mg/mL施保克水溶液、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL抗菌肽粗提物水溶液浸泡2 min，取出后自然風干，用聚乙烯自封袋（36 mm×26 mm，厚0.05 mm）包裝，每袋裝20 個果實，密封后于（25.0±0.5）℃、85%～95%相對濕度條件下貯存，并于貯藏第0、2、4、6、8天對荔枝的相關指標進行檢測。

1.3.2.2 荔枝果實感官指標的測定

好果率的測定參照李念文等[15]的方法，計算如式（3）所示。

霉變率計算如式（4）所示。

褐變指數的測定參照Scott等[16]的分級法，計算如式（5）所示。

1.3.2.3 荔枝果皮色澤的測定

色澤的測定參照McGuire[17]的方法，每組取5 顆荔枝，采用色差儀在每顆荔枝果肩不同部位測定3 次，以L值表示亮度、C值表示色度，其中a值表示紅度（色澤由紅到綠的變化），b值表示黃度（色澤由黃到藍的變化）。

1.3.2.4 荔枝果皮水分含量的測定

每組隨機取3 份果皮，每份（1.0±0.2）g，用烘箱法測定水分含量。

1.3.2.5 荔枝果皮相對電導率的測定

相對電導率的測定參照楊松夏等[18]的方法。用打孔器從果皮打取直徑0.8 mm的圓片（3 片/果），每組取10 片，加入25 mL蒸餾水浸泡30 min，使用Zeta電位測定儀測定電導率C1；再在沸水中煮15 min，迅速冷卻到室溫后測定電導率C2，相對電導率計算如式（6）所示。

1.3.2.6 荔枝果皮pH值的測定

將荔枝果皮加入液氮研磨成粉，取5 g凍粉用蒸餾水定容至50 mL，靜置提取30 min后過濾，用pH計測量濾液的pH值。

1.3.2.7 荔枝果皮花色苷含量的測定

參照張昭其等[19]的方法，采用pH值示差法檢測。

1.3.2.8 荔枝果皮多酚氧化酶和過氧化物酶活力的測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照王德培等[20]的方法，以每克果皮在415 nm波長處每分鐘吸光度變化0.001為1 個酶活力單位，單位為U/g；過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照龐學群等[21]的方法，以每克果皮在470 nm波長處每分鐘吸光度變化0.01為1 個酶活力單位，單位為U/g。

1.3.2.9 荔枝果肉營養成分的測定

將每個重復20 個果的果肉充分勻漿，用4 層紗布過濾。可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量的測定參考Cabral等[22]的方法，使用手持式折光儀測定；VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測定；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定。

1.4 數據分析

運用Origin 9.0軟件繪圖，運用SPSS 18.0軟件進行統計分析，采用單因素方差法，當方差齊時采用Duncan’s新復極差法，當方差不齊時采用Dunnett’s T3法。P＜0.05時表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽粗提物對荔枝霜疫霉菌菌絲生長的影響

圖1 抗菌肽粗提物對荔枝霜疫霉菌生長的影響Fig. 1 Effect of crude antimicrobial peptide extract on the growth of Peronophythora litchi

荔枝霜疫霉菌既是荔枝采前的主要病原菌之一，也是采后荔枝腐敗變質的重要因素[23]。由圖1可知，抗菌肽粗提物能夠有效抑制荔枝霜疫霉菌的生長，并隨其添加物質量濃度的增加，抑菌效果顯著增加（P＜0.05），其中含有抗菌肽粗提物10.0 mg/mL的培養基上，72 h的菌落凈生長直徑僅為9.9 mm，抑菌率達到63.33%。

2.2 抗菌肽粗提物對荔枝好果率的影響

圖2 抗菌肽粗提物對荔枝好果率的影響Fig. 2 Effect of crude antimicrobial peptide extract on the percentage of marketable fruits

由圖2可知，荔枝在貯藏過程中好果率呈下降趨勢，并且貯藏中后期下降迅速。對照組的好果率下降速率最快，從第4天起顯著低于施保克和抗菌肽粗提物處理組（P＜0.05）。抗菌肽粗提物組的好果率在貯藏初期下降緩慢，其中1.0 mg/mL抗菌肽粗提物組的好果率在第4天時與施保克組具有顯著性差異（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，各處理組間好果率差異減小，但仍然高于對照組，說明抗菌肽粗提物可有效提高荔枝的好果率，延長荔枝的貯藏期。

2.3 抗菌肽粗提物對荔枝霉變率的影響

由圖3可知，荔枝在貯藏過程中霉變率呈上升趨勢，并且隨貯藏時間的延長，霉變率上升速率加快。對照組的荔枝從貯藏第2天起即發生霉變現象，并且不斷加劇，在第6天時已達到28.33%。而經過施保克和抗菌肽粗提物處理過的荔枝霉變率始終較低，顯著低于對照組（P＜0.05），在第8天時，1.0 mg/mL抗菌肽粗提物組的霉變率僅為18.33%，低于施保克組，且與對照組之間具有極顯著差異（P＜0.01）。說明抗菌肽粗提物和施保克都能夠有效抑制荔枝果皮表面微生物的生長繁殖，防止荔枝霉變，但0.5 mg/mL的抗菌肽粗提物效果不及同等質量濃度的施保克，而將質量濃度提高至1.0 mg/mL后效果優于0.5 mg/mL施保克。

圖3 抗菌肽粗提物對荔枝霉變率的影響Fig. 3 Effect of crude antimicrobial peptide extract on mildewing rate of litchi fruits

2.4 抗菌肽粗提物對荔枝褐變指數的影響

圖4 抗菌肽粗提物對荔枝褐變指數的影響Fig. 4 Effect of crude antimicrobial peptide extract on browning index of litchi pericarp

荔枝果皮的褐變通常是由水分流失、pH值升高、花青素降解、相關酶的作用和微生物生長等因素引起的，并且這些因素之間往往存在相互協同作用[24]。果皮褐變嚴重影響荔枝的品質和商品價值，是縮短荔枝貯存時間的主要問題之一[25]。由圖4可知，各組荔枝在實驗過程中褐變指數呈持續上升趨勢。對照組的褐變指數始終高于施保克和抗菌肽粗提物處理組，并且從第4天起開始與其他處理組之間呈現顯著差異（P＜0.05）。在整個實驗期間，施保克處理組的褐變指數始終高于抗菌肽粗提物處理組，從第6天開始與1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組差異顯著（P＜0.05）。說明抗菌肽粗提物能夠顯著抑制荔枝果皮的褐變，并且效果優于施保克。

2.5 抗菌肽粗提物對荔枝果皮色澤的影響

果皮色澤的變化可以客觀地反映出荔枝在貯藏過程中的褐變情況。L值表示亮度，由圖5A可知，實驗過程中荔枝果皮L值呈下降趨勢。在貯藏初期各組間差異不顯著（P＞0.05），至中期對照組L值迅速下降，6 d后下降速率有所減慢。施保克處理組的L值在貯藏中后期高于對照組，在第4天時與對照組差異顯著（P＜0.05）。抗菌肽粗提物組L值始終高于對照組，且各處理組在4～6 d均與對照組具有顯著性差異（P＜0.05），貯藏后期與對照組逐漸接近，其中1.0 mg/mL的抗菌肽粗提物處理組的L值最大。

圖5 抗菌肽粗提物對荔枝果皮L值（A）和C值（B）的影響Fig. 5 Effect of crude antimicrobial peptide extract on L (A) and C value (B) of litchi pericarp

C值表示色度，體現荔枝果皮色澤的飽和度。由圖5B可知，實驗前期各組C值總體變化不大，貯藏至6 d后，抗菌肽粗提物處理組和施保克處理組開始顯著高于對照組（P＜0.05），但各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。實驗后期各組C值均有所下降，對照組C值仍處于最低水平。綜合L值和C值可知，抗菌肽粗提物能夠顯著抑制果皮亮度和色度的下降，效果優于施保克。各處理組L值和C值的變化規律與果皮褐變指數具有負相關性。

2.6 抗菌肽粗提物對荔枝果皮水分含量的影響

圖6 抗菌肽粗提物對荔枝果皮水分含量的影響Fig. 6 Effect of crude antimicrobial peptide extract on moisture content of litchi pericarp

荔枝在貯藏過程中果皮水分會隨果實自身的呼吸代謝而不斷流失，當果實受到微生物侵染時，果皮結構的完整性下降，水分流失增加，而果皮的水分含量與褐變是息息相關的。由圖6可知，各組荔枝果皮水分含量均呈下降趨勢。對照組的果皮水分含量始終處于最低水平，并且在貯藏后期下降速率加快。抗菌肽粗提物組和施保克組的果皮水分含量均高于對照組，從第6天起與對照組差異顯著（P＜0.05），其中1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組水分含量最高，但各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。說明抗菌肽粗提物能夠在一定程度上減少荔枝果皮的水分流失，有利于減少褐變，延長荔枝果實的貯藏時間。

2.7 抗菌肽粗提物對荔枝果皮相對電導率的影響

圖7 抗菌肽粗提物對荔枝果皮相對電導率的影響Fig. 7 Effect of crude antimicrobial peptide extract on relative conductivity of litchi pericarp

荔枝采收后，隨細胞內的呼吸代謝作用持續進行，細胞膜透性增加，導致生物膜系統受損，從而加劇了荔枝果實的衰老和變質。相對電導率與細胞膜透性具有一定的正相關性，可以用相對電導率來表征細胞膜透性，從而反映果皮細胞衰老和破壞的程度[18]。由圖7可知，在實驗過程中荔枝果皮相對電導率呈上升趨勢。對照組的果皮相對電導率高于其他處理組，至第4天顯著高于施保克組和1.0 mg/mL抗菌肽粗提物組（P＜0.05），從第6天起與其他處理組均具有顯著差異（P＜0.05）。1.0 mg/mL抗菌肽粗提物組的相對電導率最低，但與其他處理組之間無顯著差異（P＞0.05）。說明抗菌肽粗提物有利于延緩荔枝果皮相對電導率的上升，保持果皮的完整性，有利于荔枝的貯藏。

2.8 抗菌肽粗提物對荔枝果皮pH值的影響

圖8 抗菌肽粗提物對荔枝果皮pH值的影響Fig. 8 Effect of crude antimicrobial peptide extract on pH of litchi pericarp

荔枝在貯藏過程中，表皮水分的流失會引起果皮pH值升高，從而導致果皮組織顯微結構被破壞，發生細胞破裂、底物溢出等現象，加速了果皮的衰老和褐變；另外，pH值的變化會改變花色苷結構，當pH值高于4.69時，花色苷就開始褪色和變褐[26]。因此抑制果皮pH值的上升對采后荔枝的保鮮和防止荔枝褐變具有重要的意義，在生產中，采后荔枝就常用浸酸處理來改善荔枝果皮褐變[27]。

由圖8可知，在實驗過程中荔枝果皮pH值總體呈上升趨勢，尤其從第2天后加速上升。對照組果皮pH值上升最快，至第6天已經超過5.0。施保克處理組果皮pH值低于對照組，從第4天起具有顯著性差異（P＜0.05）。抗菌肽粗提物處理組果皮pH值較低，第2天時甚至低于初始值，這是由于抗菌肽粗提物中含少量的乳酸，呈天然弱酸性所致。隨著貯藏時間的延長，抗菌肽粗提物組果皮pH值緩慢上升，但始終低于對照組和施保克組，其中1.0 mg/mL抗菌肽粗提物組果皮pH值最低，至第8天時仍然低于4.9，與對照組具有極顯著差異（P＜0.01）。結果表明，抗菌肽粗提物和施保克能延緩荔枝貯藏過程中果皮pH值上升，其中抗菌肽粗提物的作用更明顯，可延緩荔枝果皮的褐變和衰老。

2.9 抗菌肽粗提物對荔枝果皮花色苷含量的影響

圖9 抗菌肽粗提物對荔枝果皮花色苷含量的影響Fig. 9 Effect of crude antimicrobial peptide extract on anthocyanin content of litchi pericarp

花色苷是一類水溶性黃烷類植物色素，是導致荔枝褐變的重要物質之一，其結構容易受到pH值和溫度等因素的影響[19]。由圖9可知，常溫下荔枝果皮花色苷含量在貯藏過程中呈下降趨勢，并且與荔枝的褐變指數具有負相關性，與張昭其等[19]的研究結果一致。對照組果皮花色苷含量下降較快，貯藏4 d后顯著低于其他處理組（P＜0.05）。貯藏過程中施保克組和抗菌肽粗提物處理組果皮花色苷含量緩慢降低，并且抗菌肽粗提物處理組花色苷含量高于施保克處理組，其中1 mg/mL抗菌肽粗提物組下降較慢，從第6天起已顯著高于施保克處理組（P＜0.05）。結果表明，抗菌肽粗提物能夠抑制荔枝在貯藏過程中果皮花色苷含量下降，可能是由于抗菌肽粗提物所具有的廣譜抗菌性及其降低果皮pH值的作用所致。

2.10 抗菌肽粗提物對荔枝果皮PPO和POD活力的影響

圖10 抗菌肽粗提物對荔枝果皮PPO（A）和POD（B）活力的影響Fig. 10 Effect of crude antimicrobial peptide extract on PPO activity (A)and POD activity (B) of litchi pericarp

荔枝在貯藏過程中，隨著細胞膜透性的增加，細胞內多種有機物釋放出來，成為酶促褐變的底物，其中PPO和POD在褐變過程中具有重要作用[28-29]。并且PPO和POD能夠共同氧化酚成醌，醌轉變成縮合型鞣制，最后形成褐色的聚合體[30]。

由圖10A可知，貯藏期間各組荔枝果皮PPO活力總體呈上升趨勢，但前期上升較緩慢，中后期上升速率加快。各處理組間荔枝果皮PPO活力在前2 d內差異不明顯，4 d后對照組的果皮PPO活力顯著上升（P＜0.05），且顯著高于其他處理組（P＜0.05），然后上升速率有所減慢，至第8天時接近其他處理組。抗菌肽粗提物處理組和施保克處理組的果皮PPO活力在前4 d內較低，4 d后迅速上升，其中0.5 mg/mL抗菌肽粗提物處理組略低于施保克處理組，但無顯著性差異（P＞0.05）；而1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組在貯藏后期處于最低水平。

由圖10B可知，各處理組荔枝在常溫貯藏過程中果皮POD活力均呈現先上升后下降的趨勢，在第6天達到峰值。對照組荔枝果皮POD活力在貯藏前期迅速上升，且高于其他處理組。施保克處理組和抗菌肽粗提物處理組荔枝果皮POD活力呈交替上升趨勢，在第6天時抗菌肽粗提物處理組果皮POD活力顯著低于對照組（P＜0.05），其中1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組的POD活力最低，比對照組低8.44 U/g，0.5 mg/mL抗菌肽粗提物處理組次之。

以上結果表明，抗菌肽粗提物能夠有效延緩荔枝果皮PPO和POD活力上升，且效果優于施保克，對荔枝褐變及衰老的控制具有積極意義。

2.11 抗菌肽粗提物對荔枝果肉營養成分含量的影響

荔枝果肉中含有豐富的營養物質，不僅使荔枝具有營養價值，也賦予其良好的口感。由圖11A可知，貯藏前期各組荔枝TSS含量略微上升，各組間差異不顯著（P＞0.05）。隨著貯藏時間的延長，對照組TSS含量迅速下降，施保克處理組和抗菌肽粗提物處理組TSS含量下降較緩慢，至第8天顯著高于對照組（P＜0.05），但各處理組間無顯著性差異（P＞0.05）。

對于荔枝果肉的還原糖含量（圖11B），各處理組均呈先上升后下降的趨勢，這是由于荔枝采收后果實不斷成熟，一部分淀粉轉化為還原糖。對照組的還原糖含量變化范圍最大，在第2天時上升至24.78%，隨后迅速降低，顯著低于其他處理組（P＜0.05）。施保克處理組和抗菌肽粗提物處理組的還原糖含量也在第2天時達到峰值，隨后不斷降低，但始終高于對照組。貯藏第8天時，各處理組間還原糖含量出現較大差異，其中1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組的還原糖含量最高，比對照組高2.49%。

由圖11C可知，荔枝在貯藏過程中果肉VC含量不斷下降，并且在前2 d內迅速下降，這與VC容易發生氧化反應有關；隨著貯藏時間的延長，下降趨勢逐漸趨于平緩。對照組果肉VC含量下降最快，在貯藏第2天已顯著低于其他處理組（P＜0.05）；施保克處理組和0.5 mg/mL抗菌肽粗提物處理組的VC含量下降速率次之，1.0 mg/mL抗菌肽粗提物處理組VC含量始終高于其他處理組，并且從第6天后與施保克處理組具有顯著性差異（P＜0.05）。

以上結果表明，抗菌肽粗提物能夠顯著抑制荔枝果肉在常溫條件下貯藏過程中TSS、還原糖和VC含量下降，使荔枝果肉保持較高的營養價值，且效果優于0.5 mg/mL施保克。

3 結 論

本研究表明，抗菌肽粗提物對荔枝霜疫霉菌具有顯著的抑制作用。在荔枝采后的常溫貯藏過程中，抗菌肽粗提物能夠顯著抑制荔枝的霉變和褐變的發生，抑制荔枝果皮水分含量和花色苷含量下降，有效延緩荔枝果皮pH值、相對電導率、PPO和POD活力上升，同時抑制荔枝果肉的TSS、還原糖和VC含量的下降。其機理可能是抗菌肽粗提物中含有天然抗菌肽F1和F3，能夠抑制荔枝在生長和采摘過程中感染的多種細菌及真菌的生長繁殖，從而維持果皮結構的完整性，減少酶促反應底物的泄露，延緩PPO和POD活力上升；同時抗菌肽粗提物中含有少量乳酸，呈天然弱酸性，有利于花色苷保持其鮮艷的色澤，并且抑制PPO和POD活力的升高，對控制荔枝褐變具有積極作用。總之，抗菌肽粗提物能夠顯著改善荔枝果實在貯藏過程中的品質，其中0.5 mg/mL抗菌肽粗提物效果優于同等質量濃度的施保克，1.0 mg/mL抗菌肽粗提物對荔枝保鮮效果更佳，能將‘桂味’荔枝常溫下的貯藏期延長1～2 d。

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