紅毛鴨胚源鵝細小病毒江西株的分離鑒定與NS 基因的分析

傅秋玲， 傅光華， 萬春和， 韋啟鵬， 陳紅梅， 黃江南， 程龍飛，施少華， 劉榮昌， 陳翠騰， 李海琴， 黃 瑜

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所， 福建 福州 350013 ；2.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所， 江西 南昌 330200)

鵝細小病毒病，又稱小鵝瘟，是由鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的1 月齡內雛鵝或雛鴨出現急性腸炎、呼吸困難、腳軟為主要癥狀，其發病率和死亡率高均可達100%，是嚴重危害水禽養殖業的重要疫病之一[1]。 該病于1956 年在我國首次報道至2014 年，該病的易感動物和臨床癥狀等均未發生明顯的變化。 然而，在2015 年后，其感染譜擴增至櫻桃谷鴨、半番鴨和麻鴨等，且臨床癥狀也發生了明顯的變化[2-3]。 該病毒能通過鵝胚、番鴨胚和半番鴨胚垂直傳播[4-6]，在其他品種水禽胚中未見報道。 本研究在開展鴨胚垂直傳播病原的檢測中，發現江西紅毛鴨胚中存在GPV 的感染，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 死亡的紅毛鴨胚采集于江西吉安某紅毛鴨孵化場；經檢測無GPV 母源抗體的10日齡番鴨胚，購自福建省溫氏有限公司；GPV 的陽性血清和膠體金試紙條由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病室研制并保存；EasyPure Viral DNA/RNA 抽提試劑盒(QIAGEN 公司生產)；Fast Pfu DNA 聚合酶和pEASY-Blunt 載體，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 病毒的分離 無菌采集死亡的紅毛鴨胚尿囊液和胚體，胚體按樣品∶PBS=1∶3 的比例，加入無菌PBS 緩沖液(pH 值7.2)進行勻漿，樣品凍融3 次后，于4 ℃下經8 000 r/min 離心10 min 后，取尿囊液和胚體勻漿上清混合液經0.22 μm 濾器抽濾后經尿囊腔接種5 枚無母源抗體的10 日齡番鴨胚，每枚0.2 mL，37 ℃孵育，每日觀察2 次，無菌收集3 ～7 d死亡的番鴨胚胚液，經無菌檢驗后，以10 日齡番鴨胚繼續傳3 代，無菌收集含毒胚液，保存于-80 ℃。

1.3 病毒的鑒定

1.3.1 膠體金試紙條檢測 參照文獻[6]具體步驟進行膠體金試紙條檢測試驗。 結果判定標準：質控線沒有變紅色，說明試紙條不能用；質控線變紅色，檢測線變紅色，判為陽性結果；質控線變紅色，檢測線沒有變紅，判為陰性結果。

1.3.2 鴨胚中和試驗 按固定血清稀釋病毒法[7]進行鴨胚中和實驗。 將上述含病毒的尿囊液進行十倍梯度稀釋，依次取10-1-10-6的稀釋度均分2份，1 份與等體積小鵝瘟病毒陽性血清混合，另1 份作為對照與正常血清等量混合，均放置37 ℃作用1 h后，每個稀釋度的病毒血清混合液按每枚0.1 mL的劑量接種于5 枚10 日齡無母源抗體的番鴨胚，同時設病毒對照和血清對照組，置37 ℃溫箱觀察培養10 d，每天觀察記錄死亡情況，并按Reed-Muench 法計算病毒中和組的ELD50、病毒對照組的ELD50及其中和指數。

1.4 NS 基因的克隆分析

1.4.1 引物設計 參照GenBank 中GPV NS 基因，利用DNAStar 設計PCR 引物，引物F、R 分別對應于GPV 基因組序列的537 ～558 位和2 395 ～2 420 位核苷酸，產物長度為1 884 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 引物序列分別為上游引物F：5′-ATG GCA CTT TCT AGG CCT CTT-3′和下游引物R：5′-TTA TTG TTC ATT TTC AGC ATC ATC A-3′。

1.4.2 基因片段的克隆 按照EasyPure Viral DNA/RNA 抽提試劑盒說明書，提取收集的尿囊液的DNA，以此作為PCR 模板進行PCR 反應，50 μL PCR 反應體系為：5 ×Buffer 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Fast Pfu DNA polymerase(5U/μL) 0.5 μL，上游和下游引物(20 pmol. L-1)各1 μL，模板2 μL，用ddH2O補充體積為50 μL，分別參照[6]PCR 反應條件進行目的產物的擴增。

1.4.3 PCR 產物測定分析 上述PCR 產物將擴增產物經瓊脂凝膠純化回收后，將目的片段克隆進平端克隆載體pEASY-Blunt，每個片段篩選3 個陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。 測序結果經DNAStar 等生物學軟件分析序列同源性及分子特征；用MEGA4.0 軟件以Neighborjoining 方法分析目的基因與GenBank 已發布的病毒序列的分子遺傳進化關系，繪制出其進化樹。

2 結果

2.1 病毒分離及GPV 膠體金檢測 利用檢測GPV的膠體金試紙條對收集的尿囊液進行病原檢測，結果顯示，C 線(質控線)上都出現條帶，說明結果有效，且T 線(檢測線)出現條帶，表明含毒尿囊液中檢測到鵝細小病毒陽性(圖1)。

圖1 膠體金試紙條檢測結果

2.2 鴨胚中和試驗 按固定血清稀釋病毒法，運用Reed-Muench 法計算病毒中和組的ELD50為10-2.36/0.1 mL，病毒對照組的ELD50為10-4.66/0.1 mL，計算血清的中和指數為102.3(102.3=199.5)，中和指數表明，所分離病毒能被鵝細小病毒陽性血清特異性中和。

2.3 NS 基因序列分析結果 本試驗以擴增鵝細小病毒NS 基因全長的引物從JX -JA -2017 分離株核酸中擴增出目的條帶(見圖2)，其大小均與預期擴增產物大小相符(1 884 bp)。 測序結果利用生物軟件進行分子特征、同源性及分子遺傳進化分析。 結果表明，本研究成功獲得了病毒JX -JA-2017 分離株的非結構蛋白基因NS，大小為1 884 bp。 該毒株NS 基因與GenBank 中從家禽中分離的鵝細小病毒的核苷酸序同源性在93.8% ～99.6%之間，氨基酸序列同源性在96.8% ～99.7%之間，其中與YZ 株核苷酸和氨基酸的同源性最高，分別99.6%、99.7%， 與SH 株的核苷酸最低(94.3%)，與重組株M15 的氨基酸同源性最低(96.8%)(見表1)。

表1 序列同源性

基于NS 基因的遺傳進化關系分析表明，JX -JA-2017 株病毒與鵝細小病毒分離株(YZ 株)同處于一個進化譜系，該進化譜系與Y，E 和YZ 等毒株同處于亞洲細小病毒分支中(見圖3)。

圖2 病毒NS 基因的擴增

圖3 小鵝瘟NS 基因序列遺傳進化樹

4 討論

近年來，鵝細小病毒的感染譜由原來的雛鵝(番鴨)擴大至櫻桃谷鴨、半番鴨、綠頭鴨、白改鴨以及褐萊鴨，且典型的臨床癥狀也發生了改變[2-3]。同時早期的GPV 只在番鴨胚、鵝胚中進行垂直傳播，我們于2015 年在半番鴨胚和剛孵化的1 日齡雛半番鴨分離鑒定出經典的GPV[6]，本研究從紅毛鴨胚檢測GPV 呈陽性，揭示GPV 的感染宿主在擴大，豐富了GPV 的流行病學內涵，為加強我國鵝細小病毒病的防控提供科學依據。

鵝細小病毒屬于細小病毒科(Parvovirus)，細小病毒屬(Parvovirus)的無囊膜單鏈DNA 病毒[8]。 該病毒全基因組大小為5 016 nt，其基因組主要由兩個開放閱讀框組成，其中包括2 種非結構蛋白(NS 和NS2)和3 種結構蛋白(VP1、VP2 和VP3)[8-9]。 目前，關于GPV 基因組研究主要集中于其結構蛋白，而對非結構蛋白的研究甚少[10]。 本研究將JX -JA -2017 株NS 基因核苷酸及編碼的氨基酸與GenBank中有代表性的13 株GPV NS 序列進行了比對，核苷酸和氨基酸的同源性分別為94% ～99.6% 和94.8% ～99.5%，豐富了GPV 的分子生態學內涵。比對結果表明，該毒株的NS 核苷酸和氨基酸均較保守，這保證了GPV 在遺傳進化中的穩定性，同時也提示該蛋白對于GPV 的功能方面起重要作用。研究發現，細小病毒的NS 蛋白在病毒DNA 復制與病毒基因、細胞基因表達調控方面起關鍵作用[10-11]。 同時，與GPV 同一屬的細小病毒(如人細小病毒、阿留申水貂病毒和犬細小病毒)的NS 蛋白是該病毒誘導宿主細胞凋亡的關鍵因素[12-14]。 到目前為止，尚未見關于GPV NS 基因與細胞凋亡的相關研究；因此，有必要深入研究GPV NS 基因與宿主之間的相互關系，這為進一步闡明GPV 的致病機制提供理論依據，亦為該病的防控奠定基礎。