不同PCR 方法檢測牛卵形巴貝斯蟲的比較分析

田萬年， 薛書江， 賈立軍， 張守發

(1.吉林農業科技學院動物科技學院， 吉林 吉林 132101；2.延邊大學農學院， 吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesia ovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細胞內所引起的寄生蟲病。 我國于1986 年在河南省盧氏縣牛體內發現本病，隨后1994 年，在甘肅張家川回族自治縣牛體內分離到卵形巴貝斯蟲[1]。 目前牛卵形巴貝斯蟲的診斷主要通過血液涂片，顯微鏡檢查為主。 PCR 方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法，已應用牛卵形巴貝斯蟲病的診斷。 Sivakumar等[2]根據AMA-1 基因建立了卵形巴貝斯蟲PCR 檢測方法。 黃國明等[3]根據卵形巴貝斯蟲CCTη 基因設計特異引物，建立了卵形巴貝斯蟲巢式PCR 診斷方法。 田萬年等[4-5]建立了卵形巴貝斯蟲熒光定量PCR 檢測方法，對延邊地區卵形巴貝斯蟲病進行了流行病學調查。 目前國內外未見關于以上3 種方法比較的文獻，本試驗從敏感性和臨床樣本檢出率方面進行對比，篩選出牛卵形巴貝斯蟲病的最佳檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本采自吉林省琿春地區散養的延邊黃牛血樣86 份，無菌采取抗凝血，用PBS洗3 次。 存于-20 ℃備用。 同時制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色鏡檢。 牛巴貝斯蟲標準基因組DNA 由日本帶廣畜產大學玄學南教授惠贈，牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA 由延邊大學農學院預防獸醫學實驗室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA 提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker、SYBR Green I Master 等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。 熒光定量PCR 儀為Agilent 公司產品。 PCR 儀為Agilent 公司產品。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank 上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA 基因序列(AY081192)，利用Primer Premier 5.0 軟件設計了4 對特異引物(見表1)。 引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 試驗所用引物信息

1.4 牛卵形巴貝斯蟲DNA 標準模板的制備 按照全血基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA 用50 μL TE 溶解， -20 ℃保存備用。

1.5 PCR 反應條件 普通PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，最后72 ℃延伸7 min。 巢式PCR 反應條件：第1 次PCR：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸7 min。 第2 次PCR：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，最后72 ℃延伸7 min；熒光定量PCR 反應條件：95 ℃5 min；94 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，共40 個循環。 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 重組質粒標準樣品的制備 經姬姆薩染色后顯微鏡鏡檢、PCR 檢測測序后確診為牛卵形巴貝斯蟲感染抗凝血，按照全血基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，應用特異性引物(巢式PCR 外引物)進行普通PCR 擴增，將PCR 產物回收，與pMD-18T 載體連接后鑒定為陽性菌株送至上海英駿生物技術有限公司測序。

1.7 不同PCR 特異性試驗 以牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA 為對照樣本。分別應用普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 進行檢測，分析其特異性。

1.8 不同PCR 敏感性試驗 將重組陽性質粒在1 ×107Copies/μL 基礎上進行10 倍倍比稀釋，最小濃度為1×100Copes /μL。 進行普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR 擴增，比較3 種方法的靈敏度。

1.9 臨床樣本的檢測試驗 應用普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 分別對采自吉林省琿春地區的86 份血液樣品進行檢測，比較3 種PCR 方法的陽性檢出率。

2 結果

2.1 不同PCR 特異性試驗 特異性試驗結果顯示，僅牛卵形巴貝斯蟲DNA 樣本擴增后出現特異性DNA 條帶，而牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲均未擴增目的條帶(見圖1、圖2)。

圖1 巢式PCR(A)和普通PCR(B)特異性試驗結果

圖2 熒光定量PCR 特異性試驗結果

2.2 不同PCR 的靈敏度檢測結果 將質粒DNA模板按10 倍倍比稀釋成1 ×107～1 ×100Copies/μL，巢式PCR 靈敏度最高，普通PCR 靈敏度最低，結果見圖3，圖4。

圖3 普通PCR(A)和巢式PCR(B)靈敏度檢測結果

圖4 熒光定量PCR 靈敏度檢測結果

2.3 不同PCR 臨床樣本檢測 分別應用血涂片鏡檢、普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 對采自吉林省琿春地區86 份血液樣本進行檢測(見表2)。結果顯示，熒光定量PCR 方法更為敏感。

表2 臨床樣本檢測結果

3 討論

目前，我國對牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過血液涂片鏡檢的常規診斷方法確診本病[6]。 卵形巴貝斯蟲傳播媒介為長角血蜱，由于長角血蜱也是瑟氏泰勒蟲的媒介蜱，因而卵形巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲?；旌细腥綶7]。 PCR 方法具有特異性強、敏感性高的優點是目前該病檢測的主要方法。 目前診斷該病PCR 方法主要有普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR，以上3 種方法對牛卵形巴貝斯蟲檢測效果比較尚未見報道。

本試驗對比了3 種PCR 方法對卵形巴貝斯蟲的檢測靈敏度和臨床樣本檢出率方面進行比較。結果表明，普通PCR 靈敏度最低，基于18S rRNA基因的巢式PCR 靈敏度是普通PCR 100 倍。 這與簡子健等[8]建立巢式PCR 檢測環形泰勒蟲比普通PCR 靈敏100 倍的結果相一致。 通過對86 份臨床樣本檢測表明，熒光定量PCR ＞巢式PCR ＞普通PCR。 普通PCR 在臨床檢測中可能出現一些漏檢，由于其檢測成本較低，適合樣本數量較大時臨床檢測。 熒光定量PCR 適合在普通PCR 檢測基礎上進行定性分析。 而巢式PCR 操作較為繁瑣，易出現假陽性，更適合技術熟練者進行臨床檢測。

綜上所述，普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 方法在牛卵形巴貝斯蟲檢測中都具有一定應用價值，在臨床中根據檢測目的，選擇與之對應的檢測方法，可作為血涂片鏡檢法的有效補充，為牛卵形巴貝斯蟲病的診斷提供參考依據。