規(guī)模化豬場偽狂犬病凈化方案應用效果的研究

郭倩妤， 湯德元， 曾智勇， 黃 濤， 王 彬， 胡玲玲， 龍冬梅，葉 麗， 石遠菊， 楊 偉， 廖少山， 劉巧玲

(貴州大學動物科學學院， 貴州 貴陽 550025)

豬偽狂犬病(PR))是由偽狂犬病病毒(PRV)引起的一種以發(fā)燒、繁殖障礙、腦脊髓炎等為主要臨床癥狀的急性、高度接觸性傳染疫病，該病屬于典型且極難防疫的自然疫源性疾病，且易與其他疫病混合感染，給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害，該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B 類動物疫病，為必須上報的動物傳染病，我國農(nóng)業(yè)部門也將其規(guī)定為Ⅱ類疫病。 目前，豬偽狂犬病已被列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)則》(2012 -2015 年)重點優(yōu)先防治的疾病，其控制目標是：到2015 年原種豬場達到凈化標準，到2020 年全國所有種豬場達到凈化標準。

隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬偽狂犬病的防控顯得尤為重要。 世界各國都己紛紛開始實施豬偽狂犬病的凈化工作，有的國家對該病的凈化已經(jīng)取得了明顯的效果。 如20 世紀80 年代末英國和丹麥等發(fā)達國家首先宣布豬偽狂犬病凈化成功，緊跟其后荷蘭、比利時等歐洲國家也相繼完成了豬偽狂犬病的凈化工作[1]。 美國也于1989 年全面開始了偽狂犬病的凈化工作，通過開展凈化措施20 年以來，取得了階段性的成果，已宣布凈化成功國內(nèi)已沒有偽狂犬病。 在我國豬偽狂犬病在大、中型豬場的陽性率在30% ～50.85%之間，有50%左右的偽狂犬野毒呈陽性，中小規(guī)模豬場和散養(yǎng)戶感染情況更高[2]。 國內(nèi)外對規(guī)模化豬場偽狂犬病的凈化方法存在一定的差異，但其思路基本一致。即撲殺、隔離、疫苗免疫及生物安全防控。 有的僅僅通過撲殺、隔離以及嚴格地對豬群進行全群檢疫監(jiān)測；有的則應用偽狂犬病基因缺失疫苗結合相應的血清學鑒別診斷方法對豬偽狂犬病進行野毒感染豬只的淘汰清除等[3]。 我國學者經(jīng)過多年的研究和探索，在豬偽狂犬病的綜合防控措施及診斷技術方面取得了飛速的發(fā)展，特別是應用偽狂犬病基因缺失疫苗免疫和gB-ELISA 和gEELISA 檢測技術在豬場偽狂犬病的凈化工作中已經(jīng)獲得了較好的效果[4-5]，為豬偽狂犬病的凈化創(chuàng)造了良好的條件。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 樣品來源于貴州省安順市實施豬偽狂犬病凈化方案的某規(guī)模化種豬場4 次采集的1 837 份全血和扁桃體樣品。

1.2 試劑 豬偽狂犬病gB、gE 蛋白ELISA 檢測試劑盒，購自武漢科前生物科技公司；LA Taq Enzyme、DNA Marker DL 2 000、TaKaRa MinBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver. 5.0、2 × 1 Step Buffer、10 mmol/L dNTPs、Taq DNA 聚合酶、RNase Free H2O，均購自TaKaRa 公司；PCR 上、下游引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。 其他常用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 偽狂犬病凈化的方案 研究通過應用偽狂犬病基因缺失疫苗免疫并對其抗體進行gE/gB-ELISA監(jiān)測(GB/T 18641 -2002)區(qū)別豬群野毒和疫苗毒感染及其疫苗免疫效果，結合本實驗室已建立的豬偽狂犬病野毒與疫苗毒病原學監(jiān)測的多重PCR 方法、合理的凈化免疫程序及健全生物安全體系4 個方面開展豬偽狂犬病得凈化研究，其凈化方案的具體技術路線如圖1 所示。

圖1 規(guī)模化豬場偽狂犬病凈化技術總路線圖

1.4 規(guī)模化豬場偽狂犬病的免疫方案 合理的免疫程序是偽狂犬病凈化的前提，采用偽狂犬病基因缺失疫苗免疫并對其抗體采用gE/gB-ELISA 監(jiān)測，可以區(qū)別豬群野毒和疫苗毒感染及其疫苗免疫效果。

1.4.1 豬偽狂犬病的免疫程序 免疫體系的建立在整個豬場生物安全體系構建中占據(jù)著重要的位置，豬場應結合自身實際建立合理的免疫程序，這是控制豬偽狂犬病的關鍵，按時免疫接種是控制本病最有效的措施之一。 在免疫方面，豬群使用Bartha-K61 株(gEˉ/gIˉ雙基因缺失疫苗株)、SA215 株(gEˉ/gIˉ/TKˉ三基因缺失疫苗株)、HB -98 株(gEˉ/gGˉ/TKˉ)或鄂A 株(TKˉ/gEˉ/gIˉ三基因缺失疫苗株)接種免疫，以防止?jié)摲腥竞徒档鸵岸靖腥娟栃月蔥6]。 需要注意的是在同一個豬場內(nèi)最好使用相同的基因缺失疫苗，避免不同基因缺失疫苗毒株之間可能發(fā)生的基因重組和毒力變異。 但是，沒有證據(jù)表明，基因缺失疫苗會與野毒發(fā)生的基因重組，因而使用基因缺失的弱毒疫苗是安全的[7-8]。仔豬56 日齡1 頭份，感染壓力較大時，可進行滴鼻免疫克服母源抗體干擾，受偽狂犬病威脅較大的豬場：仔豬出生后滴鼻0.5 頭份/頭，3 ～4 周齡再滴一次1 頭份/頭，7 ～9 周齡肌肉注射1 ～2 頭份/頭；或3 ～4 周齡滴鼻1 次，7 ～8 周齡肌肉注射1 次，留種豬只16 周齡再肌肉注射1 次。 受偽狂犬病威脅小的豬場：仔豬在14 周齡時用弱毒疫苗接種1 次；后備豬170 日齡1 頭份，配種前接種1 次(2 頭份)，間隙3 ～4 周再接種1 次；母豬產(chǎn)前25 ～30 d 接種1次；母豬每年免疫3 次，2 頭份/次(新轉入種豬15日內(nèi)免疫過不再免疫)；公豬每年免疫3 次，2 頭份/次。 基于以上免疫日齡同時需結合抗體的檢測，并根據(jù)監(jiān)測結果進一步調(diào)整適合場內(nèi)的免疫程序。對于豬偽狂犬加強仔豬選種關，對于使用基因缺失活疫苗種豬所產(chǎn)仔豬，應進行早期斷奶，保育期間對留種用的仔豬做一次野毒感染監(jiān)測，野毒感染抗體陰性的仔豬作種用，陽性仔豬則淘汰[9]。

1.4.2 偽狂犬病免疫效果監(jiān)測和凈化 對于規(guī)模化豬場進行豬偽狂犬病的凈化，其種豬和后備豬監(jiān)測比例為100%，其中種公豬1 次/半年，生產(chǎn)母豬1次/季度引進種豬混群前全免，育肥豬30 頭/群(與生產(chǎn)母豬同步檢)，監(jiān)測淘汰必須在一次或兩次以上。 采用gB 免疫抗體和gE 野毒抗體監(jiān)測技術路線如圖2 所示進行。

圖2 gB 免疫抗體和gE 野毒抗體監(jiān)測技術路線

按照gB/gE-ELISA 試劑盒操作說明書進行抗體檢測：gE 抗體ELISA 監(jiān)測其野毒感染，其原理是：現(xiàn)在許多豬場采用的是豬偽狂犬疫苗是gE(gI)單基因或多基因缺失疫苗，缺失了gE(gI)基因就不能產(chǎn)生相應的gE(gI)抗體，若gE 抗體是陽性，說明野毒感染，用此方法很容易將PRV 野毒與隱性帶毒的豬群鑒別出來以便淘汰及凈化，通過實施豬場的凈化程序后，追蹤豬群中陽性率的變化，以達到豬偽狂犬病凈化目的[10]。

gB 抗體ELISA 監(jiān)測其免疫保護情況，根據(jù)gBELISA 抗體檢測為陰性說明不受保護，對初次免疫后為gB 陰性的豬群再次進行gB 抗體ELISA 檢測，并制定合理的免疫程序方案，再次免疫接種偽狂犬疫苗，4 周后進行gB 抗體ELISA 檢測，仍為陰性的進行直接淘汰。

1.5 PRV 病原的PCR 監(jiān)測 鑒別豬偽狂犬病野毒和疫苗毒感染的三重PCR 方法的建立：參照NCBI中PRV TK (AF080571)、 gB (GQ325658) 和gE(JX417716)等基因序列，應用多重PCR 引物設計系統(tǒng)Mpprimer 和多因素引物特異性評估系統(tǒng)MFEprimer 設計三重PCR 引物，用于擴增目的基因片段，引物序列見表3 ～表1。 引物由Invitrogen 公司合成，PAGE 級，OD 值為2.0，分別取500 μL 偽狂犬病病毒Guizhou -DY 株、弱毒疫苗Bartha -K61 株及三基因缺失疫苗SA215 株接種Vero 細胞，30 h 后分別將接毒細胞懸液反復凍融3 次，4 000 r/min(室溫)離心5 min，按TaKaRa 公司核酸提取試劑盒說明書，各取200 μL 細胞懸液提取DNA，進行PCR 擴增，反應條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃45 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min 進行PCR，結果成功建立了鑒別豬偽狂犬病野毒感染和疫苗毒感染的三重PCR 方法，并將其組裝成試劑盒。 可用于區(qū)分目前使用的Bartha-K61 株、SA215 株、HB-98株和PRV 野毒感染。 該研究可快速診斷臨床血液樣品、組織樣本和拭子樣品豬偽狂犬病病毒野毒感染。 研究方法是利用本實驗室已建立的一步法從病原學區(qū)分PR 野毒與疫苗毒的多重PCR(mPCR)方法進行病原學檢測[10]，引物如表1。

表1 引物序列及片段大小

對于流產(chǎn)死胎、組織樣本、拭子樣品和PRV-gE蛋白ELISA 檢測陽性樣本與PRV-gB 蛋白ELISA 檢測陰性樣本進行病原學多重PCR 檢測，按照TaKa-Ra DNA 提取試劑盒說明書進行，利用本實驗室建立的鑒別PRV 野毒與疫苗毒的3 重PCR 方法。 當PCR 擴增產(chǎn)物電泳結果出現(xiàn)3 個片段的條帶時為PRV 野毒感染，當電泳結果出現(xiàn)281 bp 與549 bp兩片段時為PR 疫苗株Bartha-K61 時，當為PR 疫苗株SA215 時僅出現(xiàn)單獨549 bp 一個片段，以此來區(qū)分PRV 野毒與疫苗毒感染[11]。

1.6 生物安全措施的建立 豬場還應加強建立生物安全措施，主要包括：(1)豬場設立門衛(wèi)制度并在外圍設置防護網(wǎng)，嚴格限制人員、動物和運輸工具進入養(yǎng)殖場并杜絕外來人員的參觀；(2)對豬舍、欄圈、發(fā)病飼養(yǎng)場的內(nèi)外環(huán)境、用具以及運輸工具和其他一切有可能被污染的場所和設施、設備進行徹底消毒；(3)對飼料和水源進行嚴格的控制，禁止飼喂變質(zhì)的飼料，飲水每年檢測2 次以監(jiān)測大腸桿菌等細菌數(shù)；(3)堅持“自繁自養(yǎng)”( 最好建立SPF 豬群) ，堅持“全進全出”生豬調(diào)入調(diào)出前后用不同的消毒藥物徹底清洗消毒欄舍，并建立隔離檢疫舍；(4)禁止在豬場內(nèi)飼養(yǎng)其他動物，并在場內(nèi)實施滅鼠、驅(qū)蟲措施；(5)對病、死豬、死胎、流產(chǎn)物進行無害化處理；(6)制定科學的消毒程序，并嚴格執(zhí)行；(7)對于出欄的豬做好嚴格的管理：A. 明確臟區(qū)和凈區(qū)，豬只嚴格按照凈區(qū)-臟區(qū)單向流動，生產(chǎn)區(qū)工作人員禁止進入臟區(qū)；B.應保證沖洗污水不能回流到出豬臺；C. 要有防鳥網(wǎng)和防鼠措施；D. 保證每次使用后能夠及時徹底沖洗消毒。

2 結果

對該規(guī)模化豬場2016 年3 月至2017 年4 月以來進行的4 次檢測數(shù)據(jù)共計1 837 份，進行整理歸納得出相應的結果并對結果展開討論和分析以便得出更加準確的研究結論。

2.1 PRV-gB/gE 抗體陽性率第1 次檢測結果 本次研究于2016 年3 月初對安順某規(guī)模化豬445 份不同階段(種豬、后備豬、保育豬、育肥豬)豬群第1次進行PRV-gE/gB ELISA 抗體檢測，得到PRV-gB抗體陽性率為84.04%(374/445)，PRV-gE 抗體陽性率為6.29%(28/445)。 檢測后對PRV-gB 抗體陰性的豬進行加強免疫并于免疫后28 d 后抽血重測，PRV-gE 抗體陽性的豬直接淘汰。 具體檢測結果如表2。

表2 2016 年3 月第1 次PRV-gB/gE 抗體檢測結果

2.2 PRV-gB/gE 抗體陽性率第2 次檢測結果2016 年8 月進行第2 次gE/gB ELISA 監(jiān)測，共檢測不同階段豬群樣本492 份。 發(fā)現(xiàn)PRV -gB 抗體陽性率相比較第1 次有所上升，PRV-gE 抗體陽性率有所下降，分別為91.67% (451/492)、3.87% (19/492)，檢測后對PRV-gB 抗體陰性的豬進行加強免疫并于免疫后28 d 后抽血重測，PRV-gE 抗體陽性的豬直接淘汰。 結果見表3。

表3 2016 年8 月第2 次PRV-gB/gE 抗體檢測結果

2.3 PRV-gB/gE 抗體陽性率第3 次檢測結果2016 年12 月進行第3 次gE/gB ELISA 監(jiān)測，共檢測452 份樣品。 結果顯示，PRV-gB 抗體陽性率任然呈增長趨勢，PRV-gE 抗體陽性率繼續(xù)下降，分別為94.25% (426/452)、2. 21% (10/452、)，檢測后對PRV-gB 抗體陰性的豬進行加強免疫并于免疫后28 d后抽血重測，PRV-gE 抗體陽性的豬直接淘汰。結果見表4。

2.4 PRV-gB/gE 抗體陽性率第4 次檢測結果2017 年4 月完成了此次試驗的最后1 次gE/gB ELISA 監(jiān)測。 對不同階段(種豬、后備豬、保育豬、育肥豬)豬只樣本共448 份進行檢測，本次檢測可以明顯的看出，PRV-gB 抗體陽性率較2016 年3 月第一次檢測時高出許多，PRV-gE 抗體陽性率下降顯著，分別為97.99%(439/448)、0%(0/448)，相關數(shù)據(jù)如表5 所示。

表4 2016 年12 月第3 次PRV-gB/gE 抗體檢測結果

表5 2017年4月第4 次PRV-gB/gE 抗體檢測結果

2.5 PRV 抗原陽性率檢測結果 在進行的4 次PRV-gB/gE 抗體檢測中，將流產(chǎn)死胎、發(fā)病死亡的仔豬組織樣本和PRV-gE ELISA 檢測為陽性血液樣品和拭子樣本進行PCR 病原學檢測其抗原陽性率，4 次檢測的結果整合如表6 所示。

表6 PRV-gB/gE 抗體檢測以及PRV 抗原檢測結果匯總表

3 討論

將上述4 次檢測結果及相關表格進行匯總共1 837 份樣品對其進行統(tǒng)計學分析，以Y 軸表示各項檢測項目(PRV-gB 抗體/PRV-gE 抗體/PRV 抗原陽性率)，X 軸對應4 次檢測時間及豬種(種豬、后備豬、保育豬、育肥豬和種豬)。 通過對圖表的觀察和分析發(fā)現(xiàn)：安順某規(guī)模化豬場2016 年3 月進行第1 次檢測PRV-gB 抗體陽性率為84. 04% (374/445)，明顯低于之后的3 次檢測，而PRV-gE 抗體陽性率和PRV 抗原陽性率分別為6.29%(28/445)和2.70%(12/445)，都高于其余3 次。 這說明該規(guī)模化豬場剛開始開展凈化工作，凈化效果還不是很理想。 檢測后對PRV-gB 抗體陰性的豬進行加強免疫并于免疫后28 d 后抽血重測，對于PRV-gE 抗體陽性的豬直接淘汰。

2016 年8 月進行第2 次檢測，此次檢測表明，PRV-gB 抗體陽性率比第一次檢測有所提高，PRVgE 抗體陽性率及PRV 抗原陽性率均有所下降，分別為91.67%(451/492)、3.87%(19/492)、1.02%(5/492)，說明繼續(xù)開展偽狂犬病的凈化工作在該規(guī)模化豬場取得了初步的成效。 在進行的第3 次和第4 次檢測中，都可明顯的看出PRV-gB 抗體陽性率在不斷增長，PRV-gE 抗體陽性率及PRV 抗原陽性率直線下降。 兩次檢測結果分別為94. 25%(426/452)、2. 21% (10/452、)、0. 22% (1/452)和97.99% (439/448)、0. 00% (0/448)、0. 00% (0/448)，說明繼續(xù)使用本實驗室建立的規(guī)模化豬場偽狂犬病凈化方案取得了較好的應用效果，有助于該場早日完成偽狂犬病的凈化工作。

如封二彩版圖3 所示，通過對柱狀圖和其趨勢線的觀察分析，發(fā)現(xiàn)該豬場PRV 的每個檢測項目之間在一定的差異，可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，在該規(guī)模化豬場實施本實驗室建立的偽狂犬病凈化以來，PRVgB 抗體陽性率呈明顯的上升趨勢，說明該場豬群在接種PRV 疫苗后受豬偽狂犬病抗體的保護得到了加強：PRV-gE 抗體陽性率以及PRV 抗原陽性率明顯呈下降的趨勢，這說明該規(guī)模化豬場偽狂犬病野毒帶毒下降，對規(guī)模化豬場PRV 野毒取得了有效的控制作用。

通過上述統(tǒng)計學圖表進行分析討論，得出結論為，在第4 次檢測結果中種豬、后備豬、保育豬、育肥豬的PRV-gB 抗體陽性率分別為98.73%、98.64%、95.89%、97.14%，說明本實驗室建立的凈化方案的免疫已達到合格，在該規(guī)模化豬場起到了很好地免疫保護作用；在所進行的4 次PRV 抗體及抗原檢測中，該規(guī)模化豬場PRV 抗原陽性率分別為2.70%(12/445)、1.02%(5/492)、0.22%(1/452)、0.00%(0/448)，明顯呈下降趨勢，說明自開展凈化工作以來，該規(guī)模化豬場的豬偽狂犬病病原得到了較好的控制。 4 次檢測結果綜合表明，安順某規(guī)模化豬場在開展凈化工作之后的豬PRV-gB 抗體水平均達到90%，PRV-gE 抗體陽性率及PRV 抗原陽性率均降為0，表明所開展的凈化方案對規(guī)模化豬場豬偽狂犬病的凈化工作有明顯的效果，但想要徹底的消滅豬偽狂犬病還需進一步對各規(guī)模化豬場進行全方位監(jiān)控，通過以基因缺失疫苗全面免疫并配合血樣檢測淘汰野毒抗體陽性豬的方法，首先將生產(chǎn)公豬群凈化，然后將生產(chǎn)母豬群中野毒抗體陽性豬逐步淘汰，更新的后備豬群嚴格進行血液檢查，逐步形成良性循環(huán)的更新淘汰機制，最終使生產(chǎn)種公母豬全部凈化為陰性豬群。 同時，做好消毒滅源，保護好健康豬群，最終實現(xiàn)種豬豬偽狂犬凈化與根除的目標。 種豬場、生豬人工授精站的糞尿要及時清理和處理，豬場的死胎、流產(chǎn)物、弱仔豬要高溫處理，及時清除豬場存在的傳染源；并嚴格實施凈化方案，不斷地探討和完善此凈化方案。