多浪羊不同時期卵巢蛋白提取效果研究

錢 偉， 王娟紅， 賀建忠， 陳宏偉， 鄭毛亮， 常衛華

(1.塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300 ；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

多浪羊具有常年發情的優良特性，一年四季均可發情，受長、短日照規律的影響較小，而大部分品種綿羊為季節性發情，受日照規律的影響較大，一般只在夏秋季節發情。 在規模化、集約化養殖趨勢下，最大限度挖掘家畜的繁殖潛力是經濟效益的追求所在，而季節性發情明顯限制了羊繁殖潛能的發揮。 目前對綿羊常年發情和季節性發情的分子遺傳機制還不是很清楚，只是對季節性發情的主要生理途徑有個大致了解。 無論是非細胞生物的病毒，還是具有細胞結構的真核生物及原核生物，其遺傳物質發揮作用的最終執行者均為蛋白質，蛋白質的功能與活性決定了生物體活動的所有方面[1]。 有報道在黃體期，大量蛋白如血漿銅藍蛋白，乳鐵蛋白，DMBT1 及PIGR 與免疫系統有關，CD9 和腓骨蛋白均與組織重構有關，而且myosin 9 和纖維連接蛋白在發情期和黃體明顯不同[2-3]。 隨著蛋白質提取技術和蛋白質組學技術的迅猛發展，學者對蛋白質作用機制及功能的認識逐漸加深。 在整個蛋白質研究過程中，蛋白質的正確提取和分離是最重要的一環，尤其是高質量蛋白的提取。 機體中的蛋白質通常具有種類繁多、性質差異大等特性，即使屬于同一類蛋白，同一種組織，但不同生理期、提取方法、提取效果也可能大不相同，蛋白提取優劣嚴重影響蛋白組學后續試驗，比如同位素標記相對和絕對定量試驗。 該技術在多浪羊常年發情功能蛋白的挖掘上具有非常重要的意義[4-6]。

試驗利用超聲破碎對多浪羊發情期、發情間期和妊娠期卵巢進行蛋白提取，通過質量檢測比較多浪羊不同生理時期卵巢蛋白提取效果，對卵巢組織或細胞內的蛋白組成、表達水平、修飾情況等進行系統分析，為多浪羊常年發情調控機理的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 取發情期、發情間期和妊娠期多浪羊(塔里木大學動物試驗站飼養)屠宰后立即取出卵巢，并用PBS 沖洗(pH 值7.4)組織表面，之后迅速投入液氮進行快速冷凍，并帶回實驗室-80 ℃保存備用。

1.2 主要藥品與試劑 尿素、硫脲、SDS、考馬斯亮藍G-250、β-巰基乙醇、瓊脂糖、丙烯酰胺、蛋白酶抑制劑混合物等，購自Sigma 公司；NH4HCO3、Bradford 試劑、BSA 和蛋白Marker，購自Amresco 公司；其余常規試劑，購自新疆寶信生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同時間卵巢組織蛋白提取 分別取發情期、發情間期和妊娠期多浪羊卵巢0.1 g，加0.4 mL的蛋白裂解液(8.0 mol/L 脲、50 mmol/L NH4HCO3、1 ×蛋白酶抑制劑)進行超聲破碎，設置為每次2 s，間隔10 s，共5 min，整個操作在冰上進行。 超聲破碎物在冰上放置20 min 后，10，000 r/mim(4 ℃)離心30 min，取上清轉入新管，然后將蛋白提取液分裝，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 Bradford 蛋白定量和標準曲線的繪制 采用Bradford 法對蛋白進行定量[7-8]，先將已知含量的BSA 配成不同濃度的蛋白溶液，分別測定其顯色后的光吸收值(OD 值)，根據OD 值與蛋白濃度之間的線性關系，繪制出蛋白濃度標準曲線，然后測定待測蛋白溶液顯色后的OD 值，參照BSA 標準曲線計算待測蛋白濃度。 所有操作步驟均在室溫狀態下完成。

分別取BSA 8 μg、10 μg、12 μg、14 μg、16 μg、18 μg 配成不同濃度的蛋白溶液，并測定吸光值，如果相關性R2＜0.95，標準曲線不能用于計算，重新進行試驗。 根據計算配置蛋白溶液，總體積為20 μL；同時準備被檢樣本1.0 μL，與19 μL 水混合，加入檢測酶標板，每個樣本檢測2 個復孔。 每個復孔加入200 μL Bradford 工作液，輕微吸打混勻。避光，室溫靜止放置15 min。 用酶標儀檢測，檢測波長設定在595 nm。 根據標準曲線推導出檢測蛋白的總量，并計算相應濃度。

1.3.3 SDS-PAGE 檢測蛋白完整性 選玻璃板光面，用擦鏡紙蘸無水乙醇擦凈殘留污漬，并放置板夾上方，制備約12%分離膠(超純水26 mL、30%丙烯酰胺(29∶1)32 mL、1.5 mol/L Tris -HCl 20 mL、10% SDS 0. 8 mL、 10% APS 0. 8 mL、 TEMED 0.04 mL)80 mL，約10 -15 min SDS - PAGE 膠凝固。 各取15 μg 蛋白質樣品5∶1 (v/v)加入5 ×上樣緩沖液，沸水浴5 min，14 000 r/min 離心10 min取上清，進行12% SDS-PAGE 電泳。 電泳條件：恒流14 mA，電泳時間90 min。

電泳結束后取出PAGE 膠，超純水沖洗3 ～4次。 然后將沖洗干燥的PAGE 放入托盤用考馬斯亮藍進行染色，用封口膜封住托盤后置與水平搖床上；染色結束后，用超純水沖洗膠片3 次，然后進行脫色至膠片背景為無色。 質檢判定標準如下：

A 類：質檢合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可以滿足2 次或者2 次以上試驗(iTRAQ 試驗：蛋白總量≥400 μg，Label Free 試驗：蛋白總量≥120 μg)；

B 類：質檢合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可滿足1 到2 次試驗(iTRAQ 試驗：400 μg ＞蛋白總量≥200 μg，Label Free 試驗：120 μg ＞蛋白總量≥60 μg)；

C 類：質檢合格，蛋白條帶有一定程度彌散，或蛋白有一定程度降解，蛋白總量滿足至少一次的試驗要求(iTRAQ：200 μg ＞蛋白總量≥100 μg；Label Free 試驗：60 μg ＞蛋白總量≥40 μg)，結果有一定的試驗風險，如需繼續試驗，需要客戶有風險準備；

D 類：質檢不合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，但總量不滿足1 次試驗要求(iTRAQ：蛋白總量＜100 μg；Label Free：蛋白總量＜40 μg)，需要重新提供樣品。

1.3.4 凝膠掃描 PAGE 膠染色脫色后，用圖像掃描系統(Bio -Rad)對凝膠進行圖像掃描。 掃描模式為256 灰階透視掃描，分辨率為600 dpi。 掃描完的凝膠用保鮮膜包好編號后置于4 ℃冰箱中保存，對掃描圖像進行結果分析。

2 結果

2.1 標準曲線 該試驗用Bradford 方法對發情期、發情間期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白質含量進行測定，1 mg/mL BSA 溶液作標準液制作標準曲線，標準曲線見圖1，y = 0. 033 5x + 1. 034 5； R2=0.964，由標準曲線公式可知，標準曲線相關系數為0.964，線性關系良好，可以用于多浪羊卵巢全蛋白質量的測定。

2.2 多浪羊卵巢全蛋白提取定量及SDS - PAGE電泳檢測結果 根據標準曲線，對發情間期、發情期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白質含量進行，定量結果見表1，其濃度均在8 -15 μg /μL 之間。

圖1 BSA 標準曲線

SDS-PAGE 電泳檢測結果見中插彩版圖2，從圖2 可看出，3 個時期，每個時期2 個重復，6 個樣品總蛋白在25 ～200 kDa 分子量范圍內得到有效分離。 蛋白條帶清晰、完整，蛋白無降解。 其中60 kDa左右LLY-4 和LLY -5 與其他四例樣本在該位置的蛋白豐度有些微差異。 根據判定標準：蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可以滿足2次或2 次以上試驗，質檢合格，均為A 類，可以滿足后續iTRAQ 試驗。

表1 多浪羊不同時期卵巢蛋白含量定量

3 討論

綿羊卵巢結構復雜，富含脂類及其他干擾物質，到目前為止，尚未建立一種標準化綿羊卵巢全蛋白的提取方法[9]，而且試驗蛋白樣品制備的好壞被認為是蛋白質樣品能否成功分離的關鍵步驟[10]，只有提取合格的高質量蛋白才能為動物組織特殊生理功能蛋白的研究提供基礎，因此組織蛋白提取方法、提取過程的優化或不同組織蛋白提取過程的建立仍是必須的。 Jia 等[11]以綿羊卵巢組織為研究對象，建立了卵巢蛋白雙向凝膠電泳(2 -DE)最佳體系，對卵巢蛋白提取與處理、樣品上樣量以及等點聚焦電壓、時間等條件做了優化，為其他動物卵巢組織的處理及2 -DE 提供了參考。 2014年，賈建磊等[12]通過研究不同電導率的水對綿羊卵巢蛋白提取及雙向電泳的影響發現，超純水做溶劑效果最好，去離子水次之，蒸餾水和自來水不適合做溶劑進行綿羊卵巢蛋白質組研究。 2015年，孟永海等[13]以大鼠肌肉組織為試驗材料，比較了三氯乙酸(TCA )/丙酮沉淀法、改良的TCA/丙酮沉淀法和試劑盒法對其組織蛋白提取效果，發現常規的TCA 丙酮沉淀法提取的蛋白條帶模糊，其他兩種方法的提取的蛋白條帶很清晰，蛋白沒有降解，無拖尾現象，建立并優化了組織蛋白提取方法。

本試驗利用超聲破碎方法對多浪羊發情期、發情間期和妊娠期卵巢進行蛋白提取，通過質量檢測比較多浪羊不同生理時期卵巢蛋白提取效果，發現3 個時期6 個樣品總蛋白在25 ～200 kDa 分子量范圍內得到有效分離，而且蛋白條帶清晰、完整，蛋白無降解。 其中60 kDa 左右LLY-4 和LLY-5 與其他四例樣本在該位置的蛋白條帶豐度有些微差異，但差異不顯著。 根據判定標準：蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量≥400 μg，質檢合格，均為A 類，可以滿足后續iTRAQ 試驗進行蛋白組學的研究。 該方法的試驗條件相對較低，操作簡單，不需要很多的儀器設備，相對其他方法比較便宜，廣泛性高，更適合于動物組織蛋白的大量提取，為相關的組織蛋白的提取方法提供實驗依據

綜上所述，本研究采用超聲破碎法提取純化了多浪羊不同生理時間卵巢全蛋白，質量合格，滿足后續蛋白組學研究，對多浪羊重要繁殖調控細胞或組織內的蛋白質組成、表達水平，以及蛋白質間相互作用關系等進行系統的分析，揭示蛋白質與多浪羊繁殖調控活動的內在聯系和規律，為研究多浪羊常年發情的繁殖機理提供基礎。