1 例櫻桃谷種鴨脾臟壞死綜合征病原的分離鑒定

吳海洋， 李志中， 高緒慧， 武 梅， 王曉茹， 吳郡熹， 秦立廷

(山東新希望六和集團有限公司， 山東 青島 266101)

自2006 年以來，我國北京、河北、山東等地區的櫻桃谷鴨群陸續發生了以軟腳和脾臟壞死為特征的疾病。 隨后，經過對該病病原的分離和鑒定，確定為呼腸孤病毒感染。 本試驗從山東濰坊地區1 例患有脾臟壞死的櫻桃谷種鴨體內分離病毒，通過分子生物學方法和動物回歸試驗進行病原鑒定，判定引起此次櫻桃谷種鴨脾臟壞死的病原為鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus， DRV)。 基因序列分析表明，該分離株的擴增片段與已有鴨源呼腸孤病毒的序列同源性較高，均在90%以上。 報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病料來自山東濰坊地區疑似患有脾臟壞死的某櫻桃谷種鴨養殖場。 無菌采集8日齡病死鴨的肝臟、脾臟，按1∶3的比例加入滅菌的生理鹽水，充分研磨勻漿后反復凍融3 次，8 000 r/min(4 ℃)離心5 min，取上清液， -20 ℃保存備用。

1.2 病毒分離與傳代 將處理好的病料經卵黃囊接種6 日齡的鴨胚，置于37 ℃孵化觀察。 收獲死亡鴨胚的尿囊液繼續盲傳3 代，將收獲后的尿囊液置于-80 ℃保存備用。

1.3 序列測定與分析 根據DRV S2 基因的序列，設計合成 了1 對引 物：F： 5′-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3′；R：5′-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3′，目的片段大小為300 bp。 利用設計的引物對獲得的尿囊液進行RT-PCR 擴增，擴增產物經克隆轉化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。應用DNAStar 軟件對測序結果進行序列同源性分析并繪制遺傳進化樹。

1.4 動物回歸試驗 將40 只7 日齡櫻桃谷商品肉鴨隨機分成2 組，20 只/組，通過肌肉注射第3 代的病毒尿囊液，0.5 mL/羽。 陰性對照組注射滅菌生理鹽水，0.5 mL/羽。 連續觀察7 d，記錄試驗鴨發病及病變情況。 試驗結束后，剖檢未死亡鴨，采集其肝臟和脾臟進行病毒再分離，利用RT-PCR 方法進行鑒定。

2 結果

2.1 疾病流行情況及臨床癥狀 2017 年10 月份，山東濰坊地區某種鴨場8 日齡種鴨突然發病，發病鴨主要表現為癱瘓，排白色稀便，生長發育不良。鴨群發病率為10%，死亡率為4%。 剖檢病死鴨可見，心肌出血，肝臟腫大，有大小不等的白色壞死灶、脾臟腫大、出血，表面有黃色壞死(如中插彩版圖1)。

2.2 病毒分離 將經過無菌處理的病料上清液通過卵黃囊接種6 日齡鴨胚，收獲尿囊液(命名為SG株)。 盲傳3 代后，鴨胚的死亡時間穩定在140 h ～150 h 之間，對照組均未出現死亡。 死亡鴨胚表現為胚體水腫，表面有點狀出血(如中插彩版圖2)。

2.3 序列測定與分析 應用PT -PCR 方法從SG株擴增出1 條300 bp 的條帶，與目的條帶相符(如圖3)。 將該片段與已有的DRV 序列進行比對，發現其同源性較高，均在90%以上(如圖4A)。

圖3 鴨呼腸孤病毒S2 基因的擴增

將SG 株S2 基因與GenBank 中已有的番鴨源呼腸孤病毒和北京鴨源呼腸孤病毒的S2 基因序列進行比對，分析其遺傳進化關系。 結果表明，SG 株與北京鴨源呼腸孤病毒親緣關系較近，與番鴨呼腸孤病毒關系較遠，處于不同的分支(如圖4B)。

2.4 動物回歸試驗 試驗組雛鴨于攻毒后3 d 開始發病，表現精神沉郁，第4 天部分鴨子開始出現癱瘓，第5 天、6 天各死亡1 羽(如中插彩版圖5 A)，整個試驗期死亡率為10%(2/20)。 對照組試驗鴨在整個試驗期內均未表現異常。

圖4 SG 株S2 基因同源性和遺傳進化分析

攻毒后7 d，剖殺試驗組幸存鴨和對照組鴨子，可見試驗組幸存鴨肝臟腫大有白色壞死灶(如中插彩版圖5 C)，脾臟腫大，有黃豆大小的黃色壞死灶(如中插彩版圖5 E)，對照組鴨子均無明顯病變(如中插彩版圖B、D)。

3 討論

3.1 DRV 感染最早發生于南非[1]，直到1972 年法國學者才從患病番鴨體內分離到第1 株病毒[2]。近幾年，我國流行的DRV 感染主要表現為多臟器壞死、多臟器出血和脾臟壞死3 種不同的致病型。 由于DRV 主要侵害雛鴨，并能引起病鴨生長遲緩等癥狀，給我國養鴨業造成了巨大經濟損失。 2006 年，我國北京、河北、山東等地櫻桃谷鴨和北京鴨發生的以脾臟和肝臟壞死為特征的疾病，經過對其病原學進行研究，確定為DRV 感染[3-4]。 本試驗從主要表現肝臟和脾臟不規則壞死和出血、心肌出血的櫻桃谷種鴨臟器中分離到病毒，經鑒定為DRV 感染，與之前報道一致。 Ning Li 等研究表明[5]，DRV 對櫻桃谷肉鴨具有致病作用，同樣表現為脾臟和肝臟壞死。 本試驗將分離株感染雛鴨，結果能夠復制出與自然感染病例相同的病變，并能致死雛鴨，死亡率為10%，比黃瑜等[6]報道的死亡率高，這可能與不同毒株之間致病力不同有關。 已有研究表明，禽呼腸孤病毒可以經卵垂直傳播[7]。 胡薛英等通過建立SPF 雞胚DRV 感染模型，懷疑DRV 能在雞群中垂直傳播[8]，本試驗從發病櫻桃谷種鴨中分離到病毒，說明DRV 可以感染種鴨并引起發病，所以推測現在流行的致肉鴨脾臟壞死的DRV 感染可能是由病毒垂直傳播造成。

3.2 對SG 株病毒S2 基因序列同源性分析結果表明，SG 株序列與以前分離到的病毒同源性均較高，在90%以上。 進一步分析發現，SG 株與發生于北京、山東等地的引起櫻桃谷肉鴨脾臟壞死的DRV 基因同源性最高，與主要流行與我國南方地區的MDRV 同源性相對較低。 但是，需要注意的是，SG株與從番鴨分離到的J18 株基因同源性較高，親緣關系較近，說明現在流行于山東鴨群中的DRV 可能發生了變異。