中藥皮炎片對變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

劉 萍， 胡士玲， 李一涵， 卞藝斐， 劉鐘杰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京 海淀 100193)

中藥皮炎片是治療變應(yīng)性接觸性皮炎的中獸藥，全方祛風(fēng)利濕、活血疏經(jīng)、清熱滋陰。 此方由當(dāng)歸、金銀花、黃芩、茯苓、白花蛇舌草等27 味中藥組成。 本研究對中藥皮炎片進(jìn)行一系列藥效學(xué)試驗(yàn)，以探討其抗炎機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要材料 中藥皮炎片，天津市保靈動(dòng)物保健品有限公司；氯雷他定片，西安楊森制藥有限公司；2，4-二硝基氯苯、丙酮，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠IL-4(HY-077)、IFN-γ(HY-1013)放免試劑盒，北京華英生物技術(shù)研究所。

1.2 中獸藥皮炎片、氯雷他定和DNCB 溶液的配制 皮炎片研磨成粉，蒸餾水溶解，配成1 g/mL 母液；氯雷他定(10 mg/片)50 mL 蒸餾水溶解，配成0.2 mg/mL 溶液；DNCB 溶解于丙酮與橄欖油(4∶1)溶液，配制成7% 和0.5% DNCB 溶液。 所有溶液4 ℃保存，臨用前37 ℃水浴加熱5 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級8 周齡BALB/c 雌性小鼠，體重18 ～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。 飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具系統(tǒng)。 試驗(yàn)前飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具系統(tǒng)1 周，自由攝食飲水，消除應(yīng)激。

1.4 ACD 小鼠模型的建立 致敏前1 d，剃凈小鼠腹部體毛，暴露部分皮膚，剃毛面積2 cm ×2 cm。致敏第1 天，取10 μL 7%DNCB 溶液均勻涂抹在皮膚暴露處。 第2 天強(qiáng)化致敏1 次；作為對照，第4 天暴露小鼠背部皮膚2 cm ×2 cm。 第5 天取100 μL 0.5%DNCB 溶液均勻涂抹小鼠的背部皮膚暴露處。以后每隔3 d 相同致敏劑量和方法激發(fā)背、腹部皮膚4 次(8 d，11 d，14 d，17 d)。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 小鼠隨機(jī)分為7 組，每組8 只。 分別為：空白對照組(CON)、模型對照組(ACD)、皮炎片0.3 g/kg·bw 劑量組(P1)、皮炎片0.6 g/kg·bw 劑量組(P2)、皮炎片0.9 g/kg·bw劑量組(P3)、皮炎片1.2 g/kg·bw 劑量組(P4)、氯雷他定對照組(Loratadine)。 致敏前1 d 對中藥各組和Loratadine 組小鼠相應(yīng)藥物灌胃，CON 組、ACD組小鼠蒸餾水灌胃。 1 日兩次(8：00、20：00)，每次200 μL，持續(xù)18 d。 ACD 組、Loratadine 組和中藥各組小鼠行ACD 造模，CON 組取丙酮-橄欖油(4∶1)溶液對照。 第17 d，觀察各組小鼠皮損情況、稱重并記錄。眼球采血4 ℃靜置2 h，4 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清-20 ℃保存。 完整摘取脾臟、胸腺，稱重，取背部皮膚、肝臟、腎臟，用于后期病理學(xué)檢驗(yàn)。

1.6 檢測指標(biāo)與方法 背部皮損情況評分標(biāo)準(zhǔn)：明顯紅斑、水腫、滲出或明顯角化結(jié)痂者記3 分；輕度紅斑、水腫、滲出不明顯或中度角化者記2 分；紅斑、水腫、滲出均不明顯或輕度角化者記1 分；正常皮膚記0 分。 脾指數(shù)、胸腺指數(shù)測量與計(jì)算：電子天平稱量記錄脾臟、胸腺重量。 分別以每10 g 小鼠的脾重(mg)與胸腺重(mg)作為脾指數(shù)與胸腺指數(shù)。 皮膚及肝腎病理學(xué)觀察：小鼠背部剪毛處皮膚、肝臟和腎臟組織于中性甲醛中固定24 h，更換固定液，繼續(xù)固定3 ～4 d 后，進(jìn)行后續(xù)切片制作。 血清IL-4、IFN-γ 含量測定：按試劑盒說明書操作。1.7 數(shù)據(jù)處理 SPSS17.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ±SEM)表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)試驗(yàn)組間差異性。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (皮炎片各組與氯雷他定組間以P ＞0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

2 結(jié)果

2.1 中藥皮炎片對ACD 小鼠背部皮損評分的影響

剖檢發(fā)現(xiàn)ACD 組和P1、P2 組小鼠背部脫毛、紅斑、結(jié)痂等癥狀明顯；P3、P4 組和Loratadine 組的背部有部分紅斑和極少量結(jié)痂，被毛重新生長。 背部皮損評分結(jié)果(圖1)可見，ACD 組皮損評分顯著性高于空白對照組(P ＜0.05)；P3、P4 組及Loratadine組皮損評分顯著性低于ACD 組(P ＜0.05)；P3、P4組皮損評分與Loratadine 組差異不顯著(P ＞0.05)。

圖1 背部皮損評分

2.2 中藥皮炎片對ACD 小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 從圖2 可見，ACD 組脾指數(shù)顯著性高于空白對照組(P ＜0.05)；P3、P4、Loratadine 組脾指數(shù)顯著性低于ACD 組(P ＜0.05)；P3、P4 組脾指數(shù)與Loratadine 組差異不顯著(P ＞0.05)。 從圖3 可見，ACD組胸腺指數(shù)顯著高于空白對照組(P ＜0.05)；P3、Loratadine 組胸腺指數(shù)顯著低于ACD 組(P ＜0.05)；P1、P2、P3、P4 組胸腺指數(shù)與Loratadine 組差異不顯著(P ＞0.05)。

2.3 背部皮膚病理學(xué)觀察 從中插彩版圖4 可見，P1 組(a)大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮棘層輕微變厚。P2 組(b)大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮棘層增生4-6 層細(xì)胞，皮膚表皮角化不完全。 P3 組(c)無明顯炎性細(xì)胞浸潤，表皮棘層為1-3 層細(xì)胞，符合正常皮膚結(jié)構(gòu)。 P4 組(d)和Loratadine 組(f)少量炎性細(xì)胞浸潤，明顯少于P1 組和P2 組。

2.4 中藥皮炎片對血清IFN-γ 和IL-4 含量的影響

2.4.1 血清IFN-γ 變化 從圖5 可見，ACD 組血清IFNγ 的含量顯著低于空白對照組(P ＜0.05)；P3、P4 組血清IFN-γ 含量顯著高于ACD 組(P ＜0.05)。 P1、P2 組血清IFN-γ 的含量與Loratadine 組差異不顯著(P ＞0.05)。

圖2 脾指數(shù)評分

圖3 胸腺指數(shù)評分

圖5 血清IFN-γ 含量

2.4.2 血清IL-4 變化 從圖6 可見，ACD 組血清IL-4 含量顯著高于空白對照組(P ＜0.05)；P4 組血清IL-4 含量顯著低于ACD 組(P ＜0.05)；P2、P3、P4 組血清IL-4 含量與Loratadine 組差異不顯著(P ＞0.05)。

2.5 中藥皮炎片對ACD 小鼠的肝腎形態(tài)學(xué)影響

圖6 血清IL-4 含量

2.5.1 肝臟病理變化 剖檢時(shí)各組小鼠肝臟未見明顯異常。 肝臟組織切片H. E. 染色結(jié)果(見中插彩版圖7)顯示，P4 組(d)肝小葉間有少量的血細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞輕微腫脹。 其余各組肝臟未出現(xiàn)明顯的病變。

2.5.2 小鼠腎臟病理變化 剖檢發(fā)現(xiàn)P4 組小鼠腎臟輕度充血。 其余組腎臟未見明顯異常。 組織H.E.染色結(jié)果(見中插彩版圖8)表明：CON 組、Loratadine 組細(xì)胞輪廓明顯，結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。P4 組(d)細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，輪廓不清晰，腎小球腫脹，無法明顯區(qū)分腎小囊結(jié)構(gòu)，伴有少量細(xì)胞裂解。

3 討論

獸醫(yī)臨床上犬貓變應(yīng)性接觸性皮炎較為常見。變應(yīng)性接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)是一種由低分子量有機(jī)物或金屬離子引起免疫系統(tǒng)發(fā)生不良反應(yīng)的皮膚性疾病，屬于典型Ⅳ型超敏反應(yīng)[1]。 臨床表現(xiàn)多為濕疹樣皮損， 急性期為紅斑、丘疹或水皰、滲出； 慢性期為皮膚苔蘚樣變、鱗屑、皸裂。 ACD 的發(fā)生與性別、年齡、皮膚多汗、皮脂多、遺傳背景及環(huán)境因素[2]等有關(guān)。 致敏性T 淋巴細(xì)胞與抗原結(jié)合，大量炎性因子釋放，大量單核細(xì)胞浸潤甚至組織變性壞死[3]。 當(dāng)前針對犬貓變應(yīng)性接觸性皮炎的藥物主要是糖皮質(zhì)激素和抗組胺藥物，雖短期抑制皮炎作用明顯，但普遍需長時(shí)間服藥，病情易反復(fù)，副作用較大，如皮膚色素沉著、萎縮和向心性肥胖[4]等。 中醫(yī)普遍認(rèn)為皮炎類疾病由風(fēng)、熱、濕三邪致病，雖有諸多證型且發(fā)病機(jī)理各不相同，但通常都有紅斑、紅疹、皮膚瘙癢、水泡等表現(xiàn)，治療上以祛風(fēng)止癢、清熱利濕為原則[5]。皮炎片全方祛風(fēng)利濕、活血疏經(jīng)、清熱滋陰，君藥為當(dāng)歸、金銀花、黃芩、茯苓。 當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血，活血止痛；金銀花清熱解毒、散熱疏風(fēng)；黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；茯苓利尿滲濕、健脾寧心[6]。

對照組小鼠被毛逐漸生長，而ACD 模型小鼠被毛雜亂、脫落形成紅斑，部分角質(zhì)化、結(jié)痂、膿皰，表現(xiàn)不同程度精神沉郁，搔扒致敏部位。 病理檢查發(fā)現(xiàn)，表皮厚度增加、細(xì)胞輕度角質(zhì)化，表皮與真皮均有大量炎性細(xì)胞浸潤。 說明本試驗(yàn)成功建立DNCB致小鼠ACD 模型。 為了進(jìn)一步研究皮炎片對ACD模型小鼠的治療作用，我們使用皮損積分和皮損處組織病理變化評估皮損情況，衡量皮膚炎癥和病變程度；測量小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)判斷皮炎片對ACD 引發(fā)的超敏反應(yīng)的抑制程度；檢測小鼠血清IL-4、IFN-γ含量，判斷Th1、Th2 細(xì)胞亞群免疫平衡情況，進(jìn)一步評估皮炎片對ACD 治療的有效性。 我們采用ACD治療常用藥氯雷他定作為陽性對照，對比皮炎片各劑量組(0.3、0.6、0.9、1.2 g/kg·bw)與氯雷他定組(2 mg/kg·bw)對小鼠ACD 的治療作用。

皮炎片給藥劑量較低(0.3 g/kg·bw、0.6 g/kg·bw)時(shí)，小鼠ACD 癥狀無明顯緩解，皮損積分無明顯變化。 病理學(xué)檢查佐證低劑量皮炎片小鼠皮損處炎性反應(yīng)較明顯；高劑量(0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw)皮炎片和氯雷他定組小鼠背部紅斑、結(jié)痂消失，被毛生長，皮損指數(shù)明顯降低。 結(jié)果佐證高劑量皮炎片有顯著抗炎作用。 0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw 劑量皮炎片給藥能明顯抑制小鼠胸腺和脾腫脹，降低胸腺和脾指數(shù)，證明中藥皮炎片對免疫功能的維護(hù)有一定的作用；胸腺和脾臟作為動(dòng)物機(jī)體重要免疫器官，評價(jià)脾指數(shù)和胸腺指數(shù)對小鼠ACD 恢復(fù)程度評判有重要意義。 當(dāng)機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)，脾臟和胸腺發(fā)生腫脹，重量增加。 0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw 劑量皮炎片顯著下調(diào)ACD 小鼠血清IL-4 水平，上調(diào)IFN-γ 水平，能有效調(diào)節(jié)Th1和Th2 細(xì)胞亞群之間的免疫平衡。 在ACD 發(fā)病進(jìn)程中，Th1 和Th2 亞群的動(dòng)態(tài)變化反映了中藥皮炎片對小鼠體內(nèi)炎癥的有效調(diào)控程度。 IFN-γ、IL-4 是Th1 和Th2 細(xì)胞亞群中具有代表性的細(xì)胞因子[7-8]，二者含量能有效反映Th1 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞的平衡態(tài)。 我們評估了高濃度給藥條件下小鼠肝臟、腎臟損傷情況。 結(jié)果表明，1.2 g/kg·bw 劑量皮炎片組小鼠腎臟輕度充血，表現(xiàn)急性腎炎癥狀，肝臟輕微病變。 可初步得出結(jié)論，高劑量長期服用皮炎片，對腎臟、肝臟造成一定損傷。

0.9 g/kg·bw 劑量中藥皮炎片能顯著緩解小鼠ACD 皮炎癥狀，上調(diào)IFN-γ 水平，下調(diào)IL-4 水平，有效調(diào)節(jié)Th1 和Th2 細(xì)胞亞群平衡。 有研究表明，皮炎片君藥當(dāng)歸主要成分APS 可調(diào)節(jié)Th1 和Th2亞群細(xì)胞的平衡[9]，有效促進(jìn)特異性免疫和非特異性免疫；白花蛇舌草多糖能顯著升高羊紅細(xì)胞攻瑰花斑結(jié)合率和淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)換率[10]；蟬蛻有明顯免疫抑制作用[11]；茯苓多糖能有效增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[12]；黃芪多糖明顯增加脾臟、胸腺重量，提高吞噬細(xì)胞吞噬能力[13]。 這些有效成分可能是皮炎片發(fā)揮抗炎作用，有效治療變應(yīng)性接觸性皮炎的主要原因。 建議后續(xù)研究中可針對其皮炎片主要活性成分、安全性檢測和毒理學(xué)研究做進(jìn)一步探討。