脈沖強光對副溶血性弧菌的殺菌效果及動力學

張瑞雪,揭晨奕,錢珍珠，袁勇軍,2,*,管 峰

(1.浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100;2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室,浙江寧波 315100)

脈沖強光(Pulsed Light,PL)是一種非熱殺菌技術,能利用廣譜(200～1100 nm)、瞬時、高強度的脈沖光能量殺滅微生物[1]。FDA于1996年批準PL可應用于殺滅食品及包裝材料表面的微生物,但劑量不得超過12 J/cm2[2]。PL對霉菌[3]、細菌[4-6]、病毒[5]及寄生蟲[7]等均有明顯的殺滅效果。目前國內外大多研究集中于脈沖強光的殺菌效果和初步的應用探討,對其殺菌動力學的研究較少。

微生物致死動力學模型可以定量評價滅菌效果,并提供適當的滅菌設計標準[8],對其實際應用具有指導意義。在傳統熱力殺菌方法中,通常描述殺菌過程中微生物致死動力學歷程的方法主要是采用一級動力學方程,如D值和Z值。加熱使微生物中的某些酶被鈍化或失活,而酶鈍化過程通常符合一級動力學方程[9]。但是PL所造成的微生物殘存活菌數的變化并不完全符合一級反應動力學方程,存在“肩部”(shoulder)或“拖尾”(tailing)現象[10]。Wooding等[11]研究表明脈沖強光滅活李斯特氏菌存在拖尾現象,一級動力學模型不適用[11]。

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌,廣泛分布在河口、近岸海水及其沉積物中,呈世界性分布,感染魚、蝦、蟹類以及甲殼類等多種水產品[12]。同時也是沿海地區由海產品引發導致急性腸胃炎和原發性敗血癥的主要致病菌[13]。目前,尚未見PL對VP殺菌的相關研究和應用的報道,本文以副溶血性弧菌為實驗菌株,以Linear、Weibull、Log-Logistic模型來擬合脈沖強光的動力學曲線,比較三種模型的擬合效果,旨在分析和確定適合描述和預測脈沖強光殺菌過程的動力學模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌(ATCC17802) 購自中國普通微生物菌種保藏中心,保存于浙江萬里學院生物與環境學院微生物實驗室;蛋白胨、瓊脂 杭州微生物試劑有限公司;氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

PL設備(ZWS-Y1-D2) 由寧波中物光電殺菌技術有限公司生產。設備由拋光不銹鋼制成,并用金屬外殼圍繞的一個處理室,備有2盞疝氣燈和一個位于中心的活動擋板。光源參數:燈管總長400 mm,極距380 mm,直徑8 mm。如圖1所示,紫外區能量占總能量18.8%,其中UVA占7.2%,UVB占7.7%,UVC占3.9%。工作參數:輻照頻率0.5或1 Hz,距離燈管中心10 cm處的單次脈沖劑量為67、92、113 mJ/cm2。紫外線峰值為247 nm,輻照度為102.8 w/cm2,脈沖寬度35 ms。

圖1 脈沖強光光譜Fig.1 Pulse light spectrum

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 稱取蛋白胨15.0 g,氯化鈉30.0 g,溶于1000 mL蒸餾水中,用1.0 mol/L NaOH調節pH至7.5,121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養基在以上配方基礎上添加2.0%瓊脂。

1.2.2 菌懸液制備 將活化好的菌株接種到液體培養基中,37 ℃培養6.0 h,按1.0%接種量接種于50 mL液體培養基中,37 ℃培養18.0 h,5000 r/min離心15 min后,收集菌體,3.0%氯化鈉鹽水洗3次,重懸浮于3.0%氯化鈉鹽水中,制成菌體懸液,4 ℃保存備用。

1.2.3 副溶血性弧菌菌懸液的脈沖強光處理 取1.0 mL樣品置于無菌培養皿(直徑90 mm)中,垂直放于距離脈沖燈下30 cm處,設置輻照劑量分別為67、92、113 mJ/cm2,分別處理0、2、4、6、8、10、15、20、25 s,設3組平行,以平均值±標準偏差匯報結果。

1.2.4 微生物計數 樣品處理后立即進行微生物計數。具體參照GB 4789.7-2013進行。PL處理后菌落數記為N(CFU/mL),未經脈沖處理的菌懸液的菌落數記為N0(CFU/mL)。殺菌效果即致死率采用菌數減少的對數值lg(N/N0)和殺菌率S(%)(式1)來表示。

S(%)=(N0-N)×100/N0

式(1)

1.3 數學模型的建立

1.3.1 Linear模型 該模型假設同一種細菌具有相同的抗逆性,致死動力學可用線性模型來描述,即細菌下降的對數值隨時間的變化呈線性變化,如式(2)所示。

lg(N/N0)=-t/D

式(2)

式中:N為處理后菌液副溶血性弧菌菌數CFU/mL;N0處理前菌液中菌落數CFU/mL;t為處理時間,s;D為指數遞減時間,即每減少90%的活菌所需要的時間,s。

1.3.2 Weibull模型 Weibull模型是一種能夠對微生物滅菌的時間概率分布進行擬合和預測的概率模型,認為同一種群中的細菌其抗逆性存在差異。其模型方程可表示為

lg(N/N0)=-btn

式(3)

式中:b為比例因子;n為形狀因子(n<1曲線呈凹形,n>1曲線呈凸形,n=1曲線呈線性);t為處理時間。

1.3.3 Log-logistc模型

lg(N/N0)=-A/(1+exp1+(τ-t)/A)

式(4)

式中:A為上下漸近線之差,lgCFU/mL;σ為微生物最大失活速率,lg CFU/mL·s-1;τ表示最大失活速率對應的時間,s。

1.4 模型的驗證和評價

用同樣的實驗方法,通過重復實驗,取得單次輻照劑量為67、92、113 mJ/cm2,輻照距離為30 cm,分別處理1、3、5、7、9、11、14、19、21 s時檢測的菌落對數減少量,與建立的副溶血性弧菌的殺菌動力學模型求得1、3、5、7、9、11、14、19、21 s時的預測值進行比較計算,進行模型有效性和可靠性的驗證。

采用SPSS 19.0和Origin 8.0對實驗數據進行Linear模型、Weibull模型、Log-logistic模型擬合處理,得到脈沖強光滅菌的動力學方程,以精確因子(Af)、偏差因子(Bf)、均方根誤差(RMSE)和決定系數(R2)四個參數作為一種定量的方法來評價模型[14-16]。公式如下:

式中：a預測值;β實測值,m實驗值個數。

2 結果與分析

2.1 輻照劑量對副溶血性弧菌殺菌效果的影響

由圖2可知,PL的輻照劑量和時間對副溶血性弧菌菌落數影響很大,不同輻照劑量下,菌落總數呈下降趨勢。在67、92、113 mJ/cm2輻照劑量下,副溶血性弧菌數隨著劑量的增加而顯著降低(p<0.05)。當2 s時,輻照劑量從67 mJ/cm2增加到113 mJ/cm2,副溶血性弧菌殘存率對數值降低了1.25 lgCFU/mL。輻照劑量增加,隨著時間延長,副溶血性弧菌殘存率對數值降低的幅度降低,不同輻照劑量之間無顯著性差異(p>0.05),趨于平穩。其原因是可能存在菌落疊加現象,光線傳播中受到傳播介質的散射、折射、衍射等現象,使到達菌落表面的光強度降低,如若細菌疊加,陰影效應造成光線無法傳播,延長時間也難以顯著降低細菌數量(p>0.05)[17]。

圖2 脈沖強光對副溶血性弧菌的致死曲線Fig.2 Pulsed light sterilization curves of Vibrio parahaemolyticus

2.2 模型擬合曲線

運用Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型擬合脈沖強光的殺菌動力學曲線,67、92、113 mJ/cm2輻照副溶血性弧菌的致死擬合曲線如圖3所示。

圖3 副溶血性弧菌在不同輻照劑量下Weibull模型、Log-logistic模型和Linear模型的擬合曲線Fig.3 Vibrio parahaemolyticus at different flash fluence with Weibull,Log-Logistic and Linear models

2.3 模型擬合度評價

Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型擬合PL對副溶血性弧菌殺菌效果的擬合方程相應參數如表1所示。副溶血性弧菌在67、92、113 mJ/cm2的脈沖輻照劑量下致死曲線擬合的有效性比較的參數R2、RMSE、Af和Bf如表2所示。結果表明,副溶血性弧菌在67 mJ/cm2輻照劑量處理下,Linear、Weibull和Log-logistic模型的R2值分別為0.966、0.995、0.967。92、113 mJ/cm2輻照劑量下,Linear模型的R2值分別為0.679、0.615。Weibull與Log-logistic模型的R2>0.9,R2趨于1擬合度越佳,由此可見,隨著輻照劑量的增加,Linear模型不再適合描述脈沖強光致死曲線,而Weibull與Log-logistic模型可以很好地描述這一過程。由表2可知,Weibull模型與Log-logistic模型參數R2、RMSE、Af和Bf整體上較為接近。Weibull模型的RMSE和Af相對于Log-logistic模型略小,說明Weibull模型預測的平均精確度較高,離散程度較低;同時Weibull模型的Bf和R2更接近于1。因此,Weibull模型較Log-logistic模型可更好的擬合脈沖強光對副溶血性弧菌致死動力學過程。

表1 3種動力學模型擬合曲線參數Table 1 Kinetic parameters of three fitting models for inactivation of Vibrio parahaemolyticus by pulsed light

表2 Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型的致死曲線擬合參數Table 2 Fitting parameters of Linear,Weibull and Log-Logistic models under different fluence

為了比較Weibull模型和Log-logistic模型回歸方程所得預測值和實測值的接近程度,如圖4所示,可知67 mJ/cm2輻照劑量下,Weibull預測值與實測值線性回歸方程:y=0.988x-0.038(R2=0.993),Log-logistic模型擬合方程:y=0.978x+0.932(R2=0.970)。實測值和預測值間一致性越好,其曲線斜率和相關性系數越接近1,方程截距越趨于0[18]。在67 mJ/cm2輻照劑量下,Weibull模型回歸方程斜率為0.988,相關系數R2為0.993,均較Log-logistic模型更趨于1,截距為0.038,也較Log-logistic模型更趨于0。當輻照劑量為92 mJ/cm2時,Weibull模型實測值與預測值回歸方程:y=0.941x-0.159(R2=0.944),Log-logistic模型實測值與預測值回歸方程:y=0.914x-0.286(R2=0.892)。Weibull模型實測值與預測值相關系數R2較Log-logistic模型實測值與預測值R2更趨于1,當輻照劑量為113 mJ/cm2時,Weibull模型實測值與預測值R2為0.987,Log-logistic模型R2為0.949,結果表明Weibull模型在脈沖強光滅活副溶血性弧菌動力學過程略優于Log-logistic模型。

圖4 脈沖強光對副溶血性弧菌殺滅效果的Weibull模型與Log-logistic模型預測值和實測值的相關性Fig.4 Correlation between observed and predicted values for inactivation of Vibrio parahaemolyticus in pulsed light according to Weibull model and Log-logistic model注:a、c、e分別為67 mJ/cm2、92 mJ/cm2和113 mJ/cm2輻照劑量下,Weibull模型預測值與實測值相關性,c、d、f分別為67、92和113 mJ/cm2輻照劑量下,Log-logistic模型預測值與實測值相關性。

3 結論

在67、92、113 mJ/cm2輻照劑量下,脈沖處理2、4、6、8、10、15、20、25 s可顯著降低副溶血性弧菌數量(p<0.05)。輻照劑量越高,處理時間越長,殺菌效果越好。113 mJ/cm2輻照劑量處理25 s,副溶血性弧菌殘存率降低5.63 lg CFU/mL,殺菌率為99.96%。

Weibull模型和Log-logistic模型較Linear模型均能更好擬合脈沖強光滅活副溶血性弧菌的動力學過程。Weibull模型R2>0.97,RMSE<0.3,Af為1.040～1.122,Bf為0.997～1.033;Log-logistic模型R2>0.92,RMSE<0.4,Af為1.089～1.103,Bf為0.948～0.994。綜上所述,Weibull模型更加簡潔、靈活實用,擬合度更高,更適用于脈沖強光殺菌條件的預測和優化。

[1]Hilton S T,Moraes J O D,Moraru C I. Effect of sublethal temperatures on pulsed light inactivation of bacteria[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2017,39(2):49-54.

[2]Food and Drug Administration. Pulsed light for the treatment of food:21 CFR 179. 4-1996[S]. USA:Food and Drug Administration,1996.

[3]唐明禮,王勃,劉賀,等.脈沖強光對煎餅表面霉菌殺菌效果及分為品質的影響[J].食品科學,2015,36(6):220-225.

[4]Yi J Y,Bae Y K,Cheigh C I,et al. Microbial inactivation and effects of interrelated factors of intense pulsed light(IPL)treatment for Pseudomonas aeruginosa[J]. LWT-Food Science & Technology,2017,77(1):52-59.

[5]Huang Y,Ye M,Cao X,et al. Pulsed light inactivation of murine norovirus,Tulane virus,EscherichiacoliO157∶H7 and Salmonella in suspension and on berry surfaces[J]. Food Microbiology,2017,61(8):1-4.

[6]Marquenie D,Lammertyn J,Geeraerd A H,et al. Inactivation of conidia of Botrytis cinerea and Monilinia fructigena using UV-C and heat treatment[J]. International Journal of Food Microbiology,2002,74(1/2):27-35.

[7]Pollock A M,Singh A P,Ramaswamy H S,et al. Pulsed light destruction kinetics of L. monocytogenes[J]. LWT-Food Science

and Technology,2017,84(8):114-121.

[8]Aetiguez M L,Martinez I M. Inactivation of spores and vegetative cells ofBacillussubtilisandGeobacillusstearothermophilusby pulsed light[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2015,28(1):52-58.

[9]劉野,張超,許勇,等.高壓二氧化碳對西瓜汁中過氧化物酶鈍化動力學的研究[J].食品工業科技,2011,32(7):160-163.

[10]Tremarin A,Brand?o T R S,Ssilva C L M. Inactivation kinetics ofAlicyclobacillusacidoterrestris,in apple juice submitted to ultraviolet radiation[J]. Food Control,2016,73(4):18-23.

[11]黃康.高壓脈沖電場處理室內多物理場對微生物滅活作用的研究[D].浙江:浙江大學,2013.

[12]胡元慶,黃玉萍,李鳳霞,等.水產品中副溶血性弧菌LAMP檢測方法的優化[J].現代食品科技,2017,33(6):313-320,247.

[13]錢紅玫,胡文忠,馮可,等.食源性致病菌快速檢測的前增菌培養的研究進展[J].食品工業科技,2016,37(13):360-364.

[14]申光輝,陳安均,陳姝娟,等.超高壓對泡蘿卜的殺菌效果及其動力學研究[J].食品科學,2016,37(5):67-71.

[15]馮海紅,易建勇,畢金鋒,等.高靜壓處理對預制綠蘆筍品質的影響[J].食品工業科技,2016,37(13):101-106,111.

[16]Loredo A B G,Guerrero S N,Alzamora S M. Inactivation kinetics and growth dynamics during cold storage ofEscherichiacoli. ATCC 11229,Listeriainnocua,ATCC 33090 andSaccharomycescerevisiaeKE162 in peach juice using aqueous ozone[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2015,29(8):271-279.

[17]張紅,李晴晴,許慶龍,等.紫外線與保鮮膜對藍莓冷藏保鮮效果的影響[J].食品工業科技,2017,38(9):314-318.

[18]Valdivia-Nájar C G,Martín-Belloso O,Giner-Seguí J,et al. Modeling the inactivation ofListeriainnocua,andEscherichiacoli,in fresh-cut tomato treated with pulsed light[J]. Food & Bioprocess Technology,2017,10(2):266-274.