溝幫子熏雞主體風味成分分析

劉登勇,吳金城,王繼業,戚 軍,徐幸蓮

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013;2.南京農業大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心,肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095)

醬鹵肉制品是中華傳統熟肉制品的典型代表,一般是原料肉在水中加調味料、香辛料等煮制而成[1]。溝幫子熏雞是我國著名的地方特色醬鹵肉制品之一,與德州扒雞、道口燒雞、符離集燒雞并稱“四大名雞”[2]。溝幫子熏雞加工工藝主要包括原料選擇與處理、浸泡、煮制、熏制等[3]。秘制配方和獨特工藝賦予溝幫子熏雞造型優美、色艷味佳、肥而不膩、軟爛連絲等特點,深受消費者喜愛。

目前有關醬鹵肉制品揮發性成分的研究較多,王學敬等[4]利用固相微萃取氣相色譜質譜聯用分析了德州扒雞的揮發性風味物質,熊國遠[5]分析比較了不同加工階段符離集燒雞的揮發性風味組分,張逸君等[6]對道口燒雞揮發性成分進行了分析,孫圳等[7]研究了定量鹵制過程及傳統鹵制雞腿肉的揮發性風味物質組分,但是關于溝幫子熏雞風味的研究鮮見報道。

固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)是一種被廣泛地應用于食品揮發性風味成分分析的前處理技術[8],但各類食品的適宜萃取條件不同。因此,本實驗以溝幫子熏雞為對象,對影響風味物質萃取的相關因素進行優化,結合氣-質聯用(gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)技術對揮發性風味物質進行分離鑒定,并對各風味成分的相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)進行計算和分析[9],探明溝幫子熏雞主體風味成分,為以后香氣檢測和研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熏雞樣品 錦州市溝幫子熏雞專賣店,質量1000～1300 g/只,選取當日生產、未經二次殺菌的散裝產品,真空包裝后置于-18 ℃貯藏備用。

Agilent 7890N/5975氣質聯用儀 美國Agilent公司;固相微萃取裝置、20 mL頂空鉗口樣品瓶、4種不同涂層SPME萃取針(表1) 美國Supelco公司。

表1 4種不同涂層SPME萃取針Table 1 Four types of fibers with different coatings

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與SPME萃取 將冷凍熏雞樣品置于4 ℃條件下緩慢解凍12 h,稱取胸肉、腿肉各100 g(帶皮),分別切成2 mm×2 mm×2 mm大小,混勻。

將適量樣品轉移至20 mL頂空瓶中,快速用聚四氟乙烯隔墊迅速封口,一定的溫度水浴加熱。用萃取針(已活化)頂空吸附后,將萃取針插入氣相色譜儀進樣口進行解吸。每個樣品重復3次。

1.2.2 GC-MS條件 氣相色譜條件:毛細管柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);前進樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1.0 mL/min;不分流模式進樣;程序升溫:初始柱溫40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至70 ℃,以5 ℃/min升至180 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

質譜條件:色譜-質譜接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;離子化方式EI;電子能量70eV;質量掃描范圍m/z 30～550。

1.2.3 定性和定量分析 樣品中的揮發性成分經氣相色譜分離后,用質譜進行分析鑒定。結果通過計算機譜庫(Nist/Wiley)進行檢索,選擇匹配度大于80的檢索結果(總值100),各化合物峰面積由軟件系統計算。利用面積歸一化法計算各揮發性成分在熏雞揮發性氣味物質中的相對含量。參考劉登勇等[9]的方法計算各成分的ROAV,并據此確定主體風味成分。

1.3 SPME條件優化

1.3.1 萃取針選取 為獲得溝幫子熏雞揮發性物質的優化條件,固定樣品質量4.0 g、預熱溫度50 ℃、預熱時間10 min、萃取溫度51 ℃、萃取時間45 min、解析溫度240 ℃、解析時間4 min,考察4種不同涂層SPME萃取針(表1)對熏雞揮發性物質總峰面積的影響。

1.3.2 Plackett-Burman設計法篩選顯著性影響因素 采用Plackett-Burman設計法,對預熱溫度、預熱時間、萃取溫度、萃取時間、解吸溫度、解吸時間、樣品質量等影響響應變量(y)的7個因素進行分析[10]。如表2所示,每個因素取兩水平,即低水平(-1)和高水平(+1)。以除去萃取針解吸產生的含硅雜質后的總峰面積為響應指標,篩選出對結果有顯著影響(p<0.05)的因素。

表2 Plackett-Burman實驗中的因素水平表Table 2 Experimental variables and levels of Plackett-Burman design

1.3.3 單因素實驗 根據篩選結果進行單因素實驗,以總峰面積為優先考察指標并輔以物質出峰數為參考,綜合評價實驗條件。具體方法如下:

樣品質量4.0 g、萃取時間50 min條件下,考察萃取溫度40、43、47、51、55 ℃ 5個水平對總峰面積的影響。

樣品質量4.0 g、萃取溫度51 ℃條件下,設定萃取時間為30、35、40、45、50 min,研究萃取時間對總峰面積的影響。

萃取溫度51 ℃、萃取時間45 min,樣品質量取3、3.5、4、4.5、5 g 5個水平,考察樣品質量對總峰面積的影響。

1.3.4 正交實驗 通過表3所示因素水平進行正交實驗分析并驗證,最終確定SPME-GC-MS法分析熏雞風味物質的分析條件。

表3 L9(34)正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of L9(34)orthogonal design

1.4 數據處理

用Minitabl6軟件分析Plackett-Burman實驗結果;使用SAS Version 9.1.3軟件進行數理統計分析。

2 結果與分析

2.1 SPME條件優化

2.1.1 不同涂層萃取針的初步篩選 本文用4種不同涂層固相微萃取針(表1)對熏雞揮發性成分進行萃取。由圖1可知,CAR/PDMS(75 μm)的萃取針萃取到的揮發性物質峰面積最大,達到8.584×108,PDMS/DVB(65 μm)萃取針次之。原因可能是熏雞揮發性物質中極性物質較多,導致非極性萃取針的效果最差,雙極性萃取針具有萃取范圍較廣的特點,其對極性揮發性物質較多的樣品萃取效果不佳[11]。為獲得最大的揮發性組分信息,本實驗選擇CAR/PSMS(75 μm)萃取針進一步對熏雞進行風味研究。

圖1 不同萃取針對揮發性成分萃取的影響Fig.1 Effect of fiber coating on the peak areas of volatiles注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.1.2 Plackett-Burman實驗篩選顯著性影響因素 Plackett-Burman實驗設計方案和結果見表4,實驗結果分析見表5。該實驗設計可通過較少的實驗次數來分析較多的影響因素,僅需考慮各因素引起的主效應,而忽略因素之間交互作用,因此該實驗用于篩選顯著影響因素(p<0.05)作為后續實驗研究重點,根據實驗情況確定非顯著影響因素(p>0.05)的取值[10]。該實驗模型中因素的主效應p值為0.012,說明在統計學上具有顯著性,不同影響因素對應p值反映了該因素的顯著性,表5中萃取溫度、萃取時間、樣品質量3個因素為顯著影響因素(p<0.05),通過后續實驗進一步說明其對萃取效果的影響;其余因素為非顯著影響因素(p>0.05),在實驗設定的條件范圍內選取條件即可,具體取值為預熱溫度50 ℃、預熱時間10 min、解吸溫度240 ℃、解吸時間4 min。

表4 Plackett-Burman實驗設計和結果Table 4 Design and results of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman因素影響表Table 5 Significance of factors in Plackett-Burman experiments

2.1.3 單因素實驗

2.1.3.1 萃取溫度對萃取效果的影響 溫度過低則不利于揮發性風味物質的揮發,影響萃取效果。較高萃取溫度下待測樣品二次加熱,可能導致新物質產生及物質之間發生一些熱反應。由圖2可知,萃取溫度達55 ℃時,峰面積達到最大值8.87×108,但與51 ℃差異性不顯著(p>0.05),綜上分析,最佳萃取溫度應在51～55 ℃范圍。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on efficiency注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05)。圖3、圖4同。

2.1.3.2 萃取時間對萃取效果的影響 SPME的原理是揮發性物質頂空濃度與萃取針涂層吸附濃度的分配平衡過程,且動態平衡時,萃取針涂層對揮發性物質吸附量與其初始頂空濃度呈正比[12]。同時待測樣品的各成分達到動態平衡所需時間不同。因此在一定范圍內控制每次實驗的萃取時間,結果具有可比性。由圖3可知,隨萃取時間的延長揮發性物質總峰面積有上升趨勢,45 min后響應值增加不顯著(p>0.05)。為提高檢驗效率,萃取時間應選擇45 min。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響Fig.3 Influence of extraction time on extraction efficiency

2.1.3.3 樣品質量對萃取效果的影響 樣品質量對萃取效果的影響見圖4。一般各類樣品所需最適樣品質量不盡相同。以總峰面積為考察指標,隨樣品質量的升高,總峰面積先升后降再逐漸升高,并在樣品質量4.5 g時達到最大值。而樣品質量為5 g時,可能由于頂空瓶中頂空體積變小,香氣成分未從樣品中充分揮發,導致總峰面積略有下降。因此在該實驗條件和環境下,樣品質量應選擇4.5 g。

圖4 樣品質量對萃取效果的影響Fig.4 Influence of sample mass on extraction efficiency

2.1.4 正交實驗結果 正交實驗設計采用L9(34),以萃取溫度(A)、萃取時間(B)、樣品質量(C)為因素,總峰面積作為評價指標,結果見表6。由結果可知萃取溫度對于總峰面積影響最大,萃取時間次之,樣品質量影響最小,優組合應為A3B2C1,即55 ℃、45 min、4.0 g，在此條件下進行驗證實驗,得到峰面積平均值為14.846×108。同時比較預熱溫度對萃取效果的影響,結果表明55 ℃萃取得到的揮發性物質峰面積最大。

表6 正交實驗結果Table 6 Results of orthogonal test

2.2 熏雞風味物質成分分析

在最優條件下測定溝幫子熏雞風味物質成分共72種,包括烴類26種、醇類7種、醛類8種、酮類3種、酸類7種、酯類5種、酚類5種、醚類4種及其它化合物7種。其中,烷烴類物質及大分子烯烴類物質閾值很高,除個別物質外,幾乎不產生明顯嗅感;16個碳原子以上的醇類、醛類、羧酸類和酯類等物質在食品中正常的濃度范圍內幾乎沒有氣味[13];這些化合物雖然含量累計占總峰面積的27.06%,但對熏雞的主體風味成分貢獻很小,所以此處不做詳細分析。其他組分均為潛在的嗅感物質,共有40種(表7),醛類化合物(7種,占34.89%)、不飽和烴類化合物(12種,占17.47%)、醇類化合物(3種,占7.4%)、酚類化合物(5種,占5.64%)、醚類化合物(4種,占4.86%)、酮類化合物(3種,占0.36%)、其他化合物(6種,占2.65%)。

表7 熏雞風味成分(n=3)Table 7 Flavor compounds in smoked chicken(n=3)

依據ROAV理論[9],溝幫子熏雞的主體風味成分有如下8種(ROAV≥1):二甲基二硫醚、己醛、檸檬烯、壬醛、芳樟醇、糠醛、庚醛、2-戊基呋喃。同時,5-甲基呋喃醛、茴香腦、草蒿腦、丁香酚、α-側柏烯、γ-萜品烯、4-萜品醇也可能對溝幫子熏雞總體風味具有重要作用(0.1≤ROAV<1)。

檢出的烴類化合物中,萜烯類對溝幫子熏雞風味貢獻較大,可能與熏雞煮制過程中,加入多種香辛料有關[14]。如檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣、柑橘味道,存在于橙子、胡椒等多種精油中;萜品烯具有令人愉悅的花香、木香,對熏雞風味具有一定貢獻。

醇類物質主要來源于不飽和脂質的氧化降解[19],一般來說,一級飽和脂肪醇閾值較高,對風味貢獻較小,不飽和醇的閾值相對較低,對風味貢獻較大。如芳樟醇具有清風香味,可能來自于熏雞煮制時添加的丁香、陳皮、白芷、良姜等香辛料中[20],而4-萜品醇和α-松油醇主要來自于香辛料肉桂、丁香和八角茴香[7]。

醛是雞肉脂肪受熱時的特征香味物質[21],而直鏈醛一般源于油脂氧化[22]。本實驗檢測出8種醛類,其中己醛、庚醛、壬醛可能是來自于熏雞加工過程中不飽和脂肪酸的氧化降解。己醛呈現清香青草氣味,庚醛具有強烈而不愉快的、粗糙刺鼻的油脂氣味,壬醛具有類似牛脂的氣息[23]。糠醛是溝幫子熏雞中是重要的特征性醛類物質,其含量最高(20.65%)且閾值較低。糠醛由溝幫子熏雞在熏制過程中蔗糖熱解產生[24],這也是其含量最高的原因,并與劉君等[25]利用糖熏工藝熏制雞肉的結果一致。糠醛可使產品具有木香、焦糖香和烘烤食品的香味[24],并且對煙熏氣味的形成有一定作用[26]。此外,肉桂醛及反式肉桂醛則可能是在溝幫子熏雞煮制過程中添加香辛料肉桂而引入的物質[27-28]。

酚類物質呈現出一種清香的氣味,是煙熏產品的特色揮發性風味物質[26]。共鑒定出酚類物質5種且相對含量為5.64%,其中乙基麥芽酚含量最高,來源是在熏雞加工過程中作為添加劑被加入,乙基麥芽酚具有增香增甜的作用,無煙熏特色風味。丁香酚有一定的煙熏氣味,主要來自于熏雞煮制過程中添加的丁香葉[20]。2,6-二叔丁基對甲酚、甲基丁香酚、間甲酚可能來自于糖熏過程中發生的美拉德反應,都具有煙熏特色風味對熏雞煙熏風味貢獻較大。

此外本實驗還檢出一定含量的酮類、酸類、酯類、胺、醚、呋喃等物質,也對溝幫子熏雞風味形成產生一定的作用。茴香腦和草蒿腦可能與煮制時加入的八角茴香等香辛料有關,它們對溝幫子熏雞特征風味的貢獻很大[20,29]。二甲基二硫醚則有強烈的洋蔥、大蒜氣味,對于熏雞獨特風味的形成具有重要貢獻。呋喃類物質是美拉德反應揮發性產物,其中2-戊基呋喃主要源于亞油酸及2-癸二烯醛氧化[30],是熏雞的主要風味成分,2-乙酰基呋喃呈現甜香以及青香味,在溝幫子熏雞風味中起著協調、平衡的作用。

本實驗借助相對氣味活度值(ROAV),對溝幫子熏雞各風味成分的實際貢獻程度進行分析評價,確定溝幫子熏雞的主體風味成分,但由于部分揮發性物質閾值未在以往文獻中查閱到,因而未做分析。

3 結論

通過對固相微萃取針進行篩選,找出適合固相微萃取的最佳萃取針為CAR/PDMS(75 μm),確定熏雞風味物質檢測條件為樣品質量4.0 g/20 mL樣品瓶、預熱溫度50 ℃、預熱時間10 min、萃取溫度55 ℃、萃取時間45 min、解吸溫度240 ℃、解吸時間4 min。該檢測條件下分析得到72種風味成分,烴類26種、醇類7種、醛類8種、酮類3種、酸類7種、酯類5種、酚類5種、醚類4種及其它化合物7種。其中,溝幫子熏雞的主體風味成分為二甲基二硫醚、己醛、檸檬烯、壬醛、芳樟醇、糠醛、庚醛、2-戊基呋喃;5-甲基呋喃醛、茴香腦、草蒿腦、丁香酚、α-側柏烯、γ-萜品烯、4-萜品醇也可能對溝幫子熏雞總體風味具有重要作用。

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