加熱溫度對牦牛肉肌原纖維蛋白與葡萄糖或果糖美拉德反應揮發性成分的影響

張 杰,唐善虎,李思寧,鄭渝川,解冰心,侯曉衛

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

牦牛肉中的肌原纖維蛋白由肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白等組成,約占肌肉蛋白總量的40%～60%[1]。動物肉中除了含有蛋白質外,還含有具有還原性的葡萄糖、核糖等物質,在熱處理過程中會發生美拉德反應,賦予食品愉快的香味和誘人的色澤[2],同時也會影響蛋白質的消化和利用[3]。目前有關美拉德反應的研究做了大量報道,趙夢瑤等[4]采用同時蒸餾萃取,萃取物再經氣相色譜-質譜聯用及芳香提取物稀釋法氣相色譜-嗅聞分析，從而對燉煮羊肉的香氣進行鑒定,共鑒定出142種揮發性成分,含量較高的為醛類;孫方達等[5]的研究以豬骨蛋白水解物和葡萄糖-木糖的混合糖作為反應原料,發現隨著pH和加熱時間的增加,反應體系的褐變程度呈現升高的趨勢。目前對于美拉德反應的研究大多是將美拉德反應產物的制備過程與其風味物質的檢測過程分開,這樣難以避免某些痕量或者微量氣味成分的揮發,最終導致測量結果不準確。除此之外,多采用模式美拉德反應即將葡萄糖和果糖等單糖與各種氨基酸直接反應,或者將肉[6]或骨[7]本身水解,再添加一定量的還原糖進行反應,從而獲得部分特定羰基供體與氨基酸供體發生美拉德反應的信息。幾乎沒有關于從牦牛肉中提取某種蛋白再與還原糖進行反應的報道。

蛋白質或氨基酸與糖產生的美拉德反應已有大量研究,目前有關從動物肉中分離出蛋白與還原糖進行美拉德反應的研究報道較少。本實驗利用GC-MS頂空進樣裝置自帶的一個溫度可達到210 ℃的加熱器,在一定程度上作為美拉德反應的發生和萃取裝置,將從牦牛肉中提取的肌原纖維蛋白與葡萄糖或果糖分別在不同溫度下進行反應,并與在坩堝中間接反應再轉移至頂空瓶中進行檢測的一組做對比,探討不同制樣方式、溫度和糖的種類對美拉德反應產物的揮發性物質的影響,為進一步探明美拉德反應機理及牦牛肉的熱加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛肉 采自四川省阿壩紅原縣國中食品有限責任公司自然放牧、健康無病屠宰排酸后牦牛的腿肌肉,去除多余的脂肪,-20 ℃下貯藏；乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氫二鈉、磷磷酸二氫鈉、鹽酸(HCl)、氯化鈉(NaCl)、葡萄糖和果糖等 均為化學分析純，成都科龍化工試劑廠。

Trace DSQ型GC-MS聯用儀(配Triplus自動進樣器) 美國Thermo公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取頭、手動固相微萃取(SPME)進樣器 美國Supelco公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MP511 Lab pH測定儀 上海三信儀表廠;TDZ5-WS離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;LD510電子秤 沈陽龍騰電子有限;JYL-D05型九陽絞肉機 九陽股份有限公司;FSH-2A可調高速組織勻漿機 江蘇金壇市醫療儀器廠;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 肌原纖維蛋白的提取參考Koutina等[8]的方法并稍有修改。前 1d,將牦牛肉于4 ℃下解凍,去筋,絞成肉糜后4 ℃冷藏,實驗當天,取牦牛肉肉糜4 g,裝入高速組織勻漿機中,添加于其4倍體積的0.05 mol/L Na2HPO4提取緩沖溶液(0.1 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA,用HCl調pH至7.0)經勻漿至均質液,在2000 r/min條件下離心15 min,棄上清液,重復三次。將經過三次提取的殘渣與4倍體積0.1 mol/L NaCl的漂洗液,勻漿30 s,在2000 r/min條件下離心15 min,棄上清液,加入8倍體積0.1 mol/L NaCl的漂洗液后再勻漿,用4層的紗布過濾去除結蹄組織后,用0.1 mol/L HCl調整溶液的pH為6.0,離心15 min(2000 r/min),棄上清液,所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.2.2 美拉德反應產物的制備 肌原纖維蛋白(J)的加入量分別為果糖(G)和葡萄糖(P)的1.5倍[9],將蛋白和糖混合均勻溶解于20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(用HCl調pH至6.0)中,并使總體積為20 mL,用烘箱控制反應溫度,在50、70、90、110、130 ℃條件下反應1 h。將在坩堝中反應后物質再轉移至頂空瓶,加果糖的標記為GJ50、GJ70、GJ90、GJ110、GJ130,加葡萄糖的標記為PJ50、PJ70、PJ90、PJ110、PJ130。將牦牛肌原纖維蛋白與葡萄糖或果糖的混合液直接加于頂空瓶中,在50、70、90、110、130 ℃進行美拉德反應，果糖和葡萄糖不同溫度處理分別標記為*GJ50、*GJ70、*GJ90、*GJ110、*GJ130或*PJ50、*PJ70、*PJ90、*PJ110、*PJ130。

1.2.3 最佳溫度下美拉德反應產物、糖類的揮發性化合物比較 在1.2.2實驗的基礎上挑選出反應最佳的組,并且增加對照組:果糖、葡萄糖和肌原纖維蛋白各自的反應，分別記為*G130、*P130、*J130。

1.2.4 氣味成分的測定 參考錢敏等[10]的研究方法并稍作修改。氣相色譜條件采用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),分流進樣,分流比為10∶1,進樣口溫度設定為260 ℃;柱溫程序:起始溫度40 ℃(保留2 min),以15 ℃/min的速度升溫至100 ℃,穩定后再以5 ℃/min的速度升溫至220 ℃,最后以10 ℃/min升到260 ℃;載氣為He,氣流速度1.0 mL/min;質譜條件選擇EI離子源,電子能量為70 eV,離子源溫度設定為230 ℃;質量掃描范圍30～550 amu。

1.3 數據分析

GC-MS結果經計算機自動檢索(NIST 08)進行定性分析,同時由Thermo Xcalibur 2.2軟件系統完成手動對照檢索,要求正反向匹配因子均大于800,最后利用面積歸一法計算已鑒定的揮發性物質的相對含量。揮發性物質相對含量按下式計算:

2 結果與討論

2.1 果糖和肌原纖維蛋白在不同溫度下反應時揮發性風味成分的變化

果糖同葡萄糖一樣也是一種十分重要的單糖,在有些食品中,果糖的含量要比葡萄糖多;另一方面,果葡糖漿在食品工業中的應用也較為廣泛,食品中的果糖與蛋白質、氨基酸等間的美拉德反應同樣會對食品的感官品質有重要影響。因此研究果糖與蛋白間的美拉德反應,可以更好的控制食品的顏色、風味和營養品質。

表1是果糖和肌原纖維蛋白在不同溫度下直接于頂空瓶中反應和在坩堝中間接反應后再轉至頂空瓶中檢測時所得的揮發性化合物的種類和相對含量。從表1中可以看出,與在坩堝中間接反應的組相比,直接在頂空瓶中反應產生的揮發性物質在含量和種類方面都多。

表1 果糖和肌原纖維蛋白在不同溫度下反應時揮發性風味成分的變化Table 1 Changes of volatile flavor components in fructose and myofibrillar protein reaction at different temperatures

續表

在50、70、90、110、130 ℃條件下,直接反應比間接反應檢測出的揮發性物質的種類分別多7、10、9、12、27種,總含量分別高5.96%、5.15%、13.03%、20.53%、86.78%;隨著溫度的升高,兩種不同制樣方式下得到的檢測物的種類和含量都增加,這與章銀良等[9]人的研究結果一致。采用直接在頂空瓶中反應，當反應溫度為130 ℃時,果糖與肌原纖維蛋白反應產生的揮發性風味物質的種類為44種,相對含量為98.72%;在反應溫度為50 ℃時,產生的揮發性風味物質最少,只能檢測出13種物質,且沒有發現酸類、烯烴類、酮類、呋喃類和吡嗪類,在該體系中含量最高的為酚類;可能是此時僅是各反應物自身的降解還未發生美拉德反應。

當反應溫度達到130 ℃時,揮發性化合物含量明顯增多,高達98.72%,并且成分也相對豐富了,尤其是對肉味貢獻較大的醛類、酮類和呋喃類;其中醛類含量最高,占總物質的37.47%,壬醛、己醛被認為是重要的肉味化合物[11-12],含量高于其他醛類化合物,對肉香味貢獻較大;除此之外糠醛含量也較高,主要是經糖的異構和脫水產生;5-羥甲基糠醛雖然含量較低,卻是*GJ130中唯一含有的物質,有研究認為5-羥甲基糠醛是高級美拉德反應的標識物[13];在*GJ130中還檢測出了其他組都沒有的呋喃類和吡嗪類化合物,這一類反應物是由氨基親核進攻羰基,進行加成和脫水反應來完成的[14]。Ouweland等[15]的研究發現從天然牛肉香味中鑒定出來的低分子量揮發性物質均可以從美拉德反應中找到原型,并且在所有品種的熟肉中都有吡嗪類化合物。但是在本研究中僅在*GJ130中發現有3種呋喃類化合物和一種吡嗪類物質,分別為2-乙酰基呋喃、聯二呋喃、3-乙酰基-2,5-二甲基呋喃和2-甲基吡嗪;其中2-甲基吡嗪是經GB 2760批準允許使用的食用香料,為無色或淡黃色的液體可以調配肉類、花生、堅果、爆米花等香型的食用香精。分析本反應體系中產生吡嗪和呋喃類化合物較少的原因可能是肌原纖維蛋白未經水解成小分子物質,沒有大量游離氨基酸為美拉德反應提供足夠的氨基來源,或者美拉德反應所需溫度未達到要求,若后續升溫可能會有大量吡嗪和呋喃類化合物產生。

綜上所述,*GJ130所檢測的化合物含量和種類最多,但是具有美拉德反應和肉風味的特征性小分子物質含量卻較少。

2.2 葡萄糖和肌原纖維蛋白在不同溫度下反應時揮發性風味成分的變化

葡萄糖與果糖,雖然都是六碳糖,但是與羰基化合物發生美拉德反應卻會產生不同的中間體,葡萄糖參與的美拉德反應產生的中間體是Amadori化合物,而果糖產生的中間體是Heyns化合物,中間體不同,產生的后續化合物也會存在差異。Hicks等[16]提出來源于Amadori化合物降解的4-羥基-5-甲基-3(2H)呋喃酮具有牛肉香味。因此有必要對葡萄糖和牛肉肌原纖維蛋白間的美拉德反應進行研究。

表2 葡萄糖和肌原纖維蛋白在不同溫度下反應時揮發性風味成分的變化Table 2 Changes of volatile flavor components in glucose and myofibrillar protein reaction at different temperatures

續表

實驗采用固相微萃取法(SPME)經GC-MS分析可知,與在坩堝中間接反應再轉至頂空瓶中檢測相比,直接在頂空瓶中反應并檢測的一組所含揮發性化合物種類變多、且部分物質含量也增高。在50、70、90、110、130 ℃加熱條件下,直接反應比間接反應檢測出的揮發性物質的種類分別多0、0、7、7、14種,總含量分別高6.20%、4.00%、0.13%、15.61%、8.94%;*PJ50、*PJ70、*PJ90、*PJ110、*PJ130分別檢測出14、18、25、29、40種揮發性風味物質;PJ50、PJ70、PJ90、PJ110、PJ130分別檢測出14、18、18、22、16種揮發性風味物質。兩種反應雖制樣方式不同卻不影響美拉德反應的進程,即隨著溫度的升高反應進行的越劇烈。

*PJ130組的揮發性風味物質的含量最高,相對含量為93.59%,分別為醛類、烷烴類、酸類、酮類、酯類、醇類、酚類和其他含氮化合物類;其中醛類化合物的含量占到了49.29%,醛類化合物中的苯甲醛具有脂香、堅果香及櫻桃味[17];辛醛和壬醛對牛肉整體風味貢獻較大[18],呂玉等人[19]用氣相色譜-嗅聞-質譜聯用分析牦牛肉的“膻味”成分，也檢測到了辛醛和壬醛,辛醛具有硫味和肉香味,壬醛具有甜味、焦味和肉香味;糠醛又叫呋喃甲醛是由葡萄糖異構和脫水產生的物質,具有苦杏仁味、焦糖味和甜味[18];葡萄糖的脫水產物2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮在反應溫度130 ℃時被檢測出來,可熱裂解產生21種化合物,具有奶香和焦甜味,這對烹飪和烘烤類食品的風味影響很大[20];其次為酮類占10.13%,其中2,3-戊二酮僅在*PJ130中檢測到,具有牛肉膻味;醛酮類化合物是肉類加熱后肉香成分的特征化合物,若除去揮發性風味物質中的醛類和酮類化合物,則肉品特有的風味就會消失,所以醛酮類化合物在產品肉香形成方面起到了不可忽略的作用[21]。

綜上所述,在頂空瓶中直接反應并檢測的一組相比在坩堝中反應再轉至頂空瓶中檢測的一組含揮發性物質的種類多、且含量高;反應溫度越高,美拉德反應產物中揮發性風味物質的種類越多、相對含量越高;*PJ130檢測的化合物含量和種類最多。

2.3 果糖或葡萄糖分別與肌原纖維蛋白在130 ℃反應時形成的揮發性化合物

各組反應產物的GC-MS分析結果見表3。從表3可知果糖、葡萄糖和肌原纖維蛋白自身的熱降解幾乎沒有風味特征,而果糖-肌原纖維蛋白和葡萄糖-肌原纖維蛋白反應體系的產物具有典型的牛肉風味物質。

表3 果糖或葡萄糖分別與肌原纖維蛋白在130 ℃反應時形成的揮發性化合物Table 3 Formation of volatile compounds in fructose or glucose respectively reacted with myofibrillar protein at 130 ℃

續表

在本實驗條件下果糖和葡萄糖的降解產物主要為醛類、酯類和酚類,其中以糠醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯和2,4二叔丁基苯酚含量較高;糠醛感官評價為具有甜香、面包香、木香、焦糖香并帶有烘烤食品的氣味,是由單糖受熱、裂解、脫水產生的[22]。肌原纖維的降解產物主要為醛類、烷烴類、醇類和酚類,這些物質中尤以肉豆蔻醛、己醛、苯甲醛、十四烷、2,4二叔丁基苯酚含量較高。果糖-肌原纖維蛋白美拉德反應體系鑒定的風味物質十六醛、硬酯烷醛、環十二烷、5-甲基-2-呋喃甲醇、2,3戊二酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、L-丙氨酰甘氨酸、2-乙酰基呋喃、聯二呋喃、3-乙酰基-2,5-二甲基呋喃、2-甲基吡嗪和羥基脲在果糖和肌原纖維蛋白自身的熱降解反應中沒有檢出;其中2,3戊二酮具有奶香、焦糖香氣和牛肉膻味,但是風味閾值較低[23];2-甲基吡嗪是經GB 2760-1996批準的允許使用的食用香料,為無色或淡黃色的液體,可以調配肉類、堅果、爆米花等香型的食用香精[24]。而葡萄糖-肌原纖維蛋白美拉德反應體系鑒定的風味物質十六醛、十八醛、環十五烷、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、1-十六烷醇、2,3-戊二酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、L-丙氨酰甘氨酸、肌酸、甲基牛磺酸、2-乙酰基呋喃、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚、肌酸酐在葡糖糖和肌原纖維蛋白自身的熱降解反應中沒有檢出;2-乙酰基呋喃具有烤肉香和熏香[17];十六醛和十八醛也是重要的肉香味化合物,常常在利用美拉德反應原理制備肉味香精化合物中檢測出[25]。

綜上所述,將果糖-肌原纖維蛋白反應體系和葡萄糖-肌原纖維蛋白反應體系作對比:硬脂烷醛、環十二烷、5-甲基-2-呋喃甲醇、聯二呋喃、3-乙酰基-2,5-二甲基呋喃、2-甲基吡嗪、羥基脲是果糖-肌原纖維蛋白美拉德反應體系特有的;十八醛、環十五烷、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、1-十六烷醇、肌酸、甲基牛磺酸、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚、肌酸酐是葡萄糖-肌原纖維蛋白美拉德反應體系特有的;并且二者的美拉德反應都可以產生重要的肉味揮發性化合物:壬醛、己醛、辛醛、十六醛、十八醛、2,3戊二酮和2-乙酰基呋喃。

3 結論

通過GC-MS聯用儀對果糖和葡萄糖分別與牦牛肉肌原纖維蛋白發生美拉德反應后的揮發性風味物質進行分析,研究發現:當在頂空瓶直接制樣并反應,溫度為130 ℃時,果糖和葡萄糖分別參與的美拉德反應所測得的揮發性風味物質的含量最大、種類也最多;其中*GJ130檢測到了44種,相對含量高達98.72%,*PJ130檢測到了40種,相對含量高達93.59%;在130 ℃時,果糖參與的美拉德反應所能檢測到的揮發性風味物質無論是種類還是含量都大于葡萄糖參與的美拉德反應,但是二者的美拉德反應都可以產生重要的肉味揮發性化合物:壬醛、己醛、辛醛、十六醛、十八醛、2,3戊二酮和2-乙酰基呋喃。

[1]魏秀麗,謝小雷,張春暉,等. 豬宰后肌肉體系中μ-calpain及肌原纖維蛋白理化特性的變化規律[J]. 中國農業科學,2015(12):2428-2438.

[2]馬相杰,謝華. 美拉德反應與肉味變化[J]. 肉類工業,2002(11):8-11.

[3]劉穎,王修俊,邱樹毅,等. 美拉德反應與食品工業[J]. 現代食品科技,2008(4):324-326.

[4]趙夢瑤,趙健,侯莉,等. 燉煮羊肉香氣物質分析鑒定[J]. 食品工業科技,2016(19):284-293.

[5]孫方達,孔保華,韓齊,等. 反應初始pH和加熱時間對豬骨蛋白水解物美拉德產物特性的影響[J]. 食品工業科技,2013(22):106-110.

[6]譚斌,丁霄霖,劉立國. 牛肉蛋白水解物的特性及其模式體系的Maillard反應[J]. 食品科學,2004(11):64-68.

[7]馬振龍,李菁,劉騫,等. 豬骨蛋白水解物與3種還原糖美拉德反應產物的理化特性及抗氧化活性的研究[J]. 食品科技,2013(4):31-36.

[8]Koutina G,Jongberg S,Skibsted L H. Protein and lipid oxidation in Parma ham during production.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2012,60(38):9737-9745.

[9]章銀良,張陸燕,周文權,等. 不同溫度對酪蛋白-木糖模式美拉德反應產物抗氧化性的影響[J]. 現代食品科技,2014(4):211-219.

[10]錢敏,白衛東,趙文紅,等. 不同氨基酸和糖對美拉德反應產物的影響[J]. 食品科學,2016(13):31-35.

[11]呂玉,宋煥祿. 不同模型體系產肉香味化合物的對比[J].食品與發酵工業,2010(1):60-63.

[13]Morales F J,Romero C,Jimenezperez S. Chromatographic determination of bound hydroxymethylfurfural as an index of milk protein glycosylation[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1997,45(5):1570-1573.

[14]Yeo H C H,Shibamoto T. Microwave-induced volatiles of the Maillard model system under different pH conditions[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1991,39(2):370-373.

[15]Ouweland G A M V,Peer H G. Components contributing to beef flavor. Volatile compounds produced by the reaction of 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone and its thio analog with hydrogen sulfide[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1975,23.

[16]Hicks K B,Feather M S. Mechanism of formation of 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone,a component of beef flavor,from Amadori products[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1975,23(5):177-188.

[17]李迎楠,劉文營,張順亮,等. 反應時間對牛肉、牛骨美拉德反應產物風味品質的影響[J]. 肉類研究,2016(5):1-5.

[18]孫麗平,汪東風,徐瑩,等. pH和加熱時間對美拉德反應揮發性產物的影響[J]. 食品工業科技,2009(4):122-125.

[19]呂玉,史智佳,曲超,等. 氣相色譜-嗅聞-質譜聯用分析牦牛肉的“膻味”成分[J]. 食品科學,2014(2):209-212.

[20]Baltes W,Knoch E. Model reactions on roast aroma formation. XIII. The formation of some uncommon N-heterocyclic compounds and furans after roasting of tryptophan with reducing sugars and sugar degradation products[J]. Food Chemistry,1993,46(4):343-349.

[21]Martins S I F S,Jongen W M F,Boekel M A J S. A review of Maillard reaction in food and implications to kinetic modelling[J].Trends in Food Science & Technology,2001,11(9-10):364-373.

[22]Gentry Trevor S,Roberts John S. Formation kinetics and application of 5-hydroxymethylfurfural as a time-temperature indicator of lethality for continuous pasteurization of apple cider[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2004,5(3):327-333.

[23]呂玉,史智佳,曲超,等. 氣相色譜-嗅聞-質譜聯用分析牦牛肉的“膻味”成分[J]. 食品科學,2014(2):209-212.

[24]Calkins C R,Hodgen J M. A fresh look at meat flavor[J]. Meat Science,2007,77(1):63.

[25]宋煥祿,楊成對. 雞肉酶解物-HVP-半胱氨酸Maillard反應體系產生肉香味化合物的研究[J]. 精細化工,2001,18(11):660-665.