鷹嘴豆納豆液態發酵高產蛋白酶的培養基及發酵條件優化

卓曉沁,趙慧瑩,何國慶

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

納豆作為特色發酵豆制品,因其獨特的滋氣味深受消費者喜愛。納豆產品的保健功效不斷受到關注,如它的抗腫瘤、抗氧化[1]和降血壓等保健功能[2];納豆對心腦血管疾病有潛在的防治作用[3],Ji等[4]探討了納豆激酶對腦缺血的作用機制。

鷹嘴豆(Chickpea)起源于中東和亞洲西部地區,是世界第二大消費豆類[5]。鷹嘴豆富含不飽和脂肪酸、蛋白質、氨基酸和粗纖維等營養素,以及核黃素、煙酸、硫胺素、葉酸等重要維生素[6-8],其發酵產物中的11S蛋白質可以降血脂[9],正釩酸鈉孵育的富釩鷹嘴豆芽可降血糖、改善脂質代謝[10]并調節膽固醇[11],鷹嘴豆白蛋白水解物可以使超氧化物歧化酶活性顯著升高,并有降低腫瘤體積、抑制腫瘤[12]等功能。鷹嘴豆作為食藥功能兼備的食品,在發酵工藝中應用范圍十分廣泛。除了鷹嘴豆乳制品的發酵[13],更多則是應用在納豆發酵中。根據底物形態不同,納豆發酵分為固態發酵和液態發酵。固態發酵中,衛拯友等[14]將鷹嘴豆代替黃豆,分離出優良的發酵用菌,采用傳統納豆生產工藝研制出口感更好的納豆,降低拉絲和氨味,其納豆激酶活力為727 U/g,比大豆納豆提高142%左右。趙倩楠[15]以生物量和納豆激酶活性為指標,通過正交實驗直觀分析得出:鷹嘴豆浸泡時間20 h、接種量1.5%、固態發酵16 h,納豆激酶酶活為21.6×102IU/g。液態發酵中,肖萍等[16]采用篩選分離所得的菌株確定了最優培養基成分:蔗糖50.0 g/L,鷹嘴豆34.85 g/L,氯化鈣0.42 g/L,硫酸鎂0.35 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L,磷酸二氫鉀6.00 g/L,優化后溶纖酶活力為3210 U/mL,比出發培養基提高了2.10倍。

目前日本在納豆相關產品的研究方面在世界上處于領先水平,而我國納豆發酵技術的掌握程度參差不齊。受發酵菌種的生長、制作工藝及產品保存特殊性的約束,納豆產品的工業化生產在我國未得到普遍推廣,關于納豆的多樣化研究在整體水平上有待提高。此外,如何提高納豆產品中的蛋白酶活力也是亟待解決的關鍵技術之一。

基于此,本研究以鷹嘴豆為主要發酵原料,以蛋白酶活力為指標對鷹嘴豆納豆的發酵效果進行考察,優化液態納豆發酵培養基的營養成分和發酵條件,以期提高納豆激酶和蛋白酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 市售；枯草納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)SG菌株 由浙江大學浙江省食品微生物重點實驗室保藏;鷹嘴豆、黃豆粕 食品級,市售;纖維蛋白原、凝血酶(1000 U) 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 西班牙BIOWEST公司;蛋白胨 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化鈉、葡萄糖、牛肉膏 國藥集團化學試劑有限公司。

PK-S28電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BSA124S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;R134A冷凍離心機 德國Eppendorf公司;ZHWY-2102恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;CTHI-250B恒溫恒濕培養箱 施都凱儀器設備(上海)有限公司;SJB-CJ-1FX超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;UPR純水儀 西安優普(Ulupure)儀器設備有限公司;600Y多功能粉碎機 鉑歐五金廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鷹嘴豆粉、豆粕粉的制備 將鷹嘴豆和豆粕用制粉機分別打磨,100目過篩備用。

1.2.2 培養基 斜面培養基:牛肉膏6 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g,加水至1000 mL,pH7.5;種子培養基:牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g,加水至1000 mL,pH7.5;發酵培養基:鷹嘴豆粉、豆粕粉及其它材料按需添加,加水至1000 mL,自然pH。發酵培養基的對照組為鷹嘴豆粉45 g,加水至1000 mL,自然pH。以上培養基均121 ℃、20 min滅菌后使用。

1.2.3 種子培養 將4 ℃保藏的枯草芽孢桿菌種經斜面培養基于37 ℃活化培養18～24 h,取一環菌種接入種子培養基中,以生長溫度37 ℃,轉速200 r/min的條件培養18 h。

1.2.4 發酵培養 根據發酵培養基的裝液量,將一定比例的種子培養基接種至其中,在一定溫度、轉速等條件下搖床發酵,測定蛋白酶活力。對照組裝液量100 mL/500 mL,發酵溫度37 ℃,轉速200 r/min。

1.2.5 酶活檢測

1.2.5.1 蛋白酶活力 Folin酚法[17]。

1.2.5.2 納豆激酶酶活 納豆激酶是一種可分泌至胞外且具有高效溶栓能力的絲氨酸蛋白酶,1987年首次被日本Sumi H人發現并命名[18]。在Astrup法[19-21]的基礎上對纖維蛋白平板的制備進行改進。將纖維蛋白源和凝血酶分別溶于pH=4磷酸鹽緩沖液中,制成0.89 mg/mL可凝結纖維蛋白溶液和7.5 U/mL的凝血酶溶液;取可凝結纖維蛋白溶液15 mL、凝血酶1 mL及瓊脂糖(0.5%)20 mL于50 ℃水浴加熱15 min,充分混合后倒入直徑為9 cm平板中冷卻備用。纖維蛋白平板法的檢測結果受孵育時間、平板厚度、測量誤差等因素的影響,因此納豆激酶酶活僅可作為輔助指標,用以檢測優化結果的準確性[22]。

1.2.6 發酵條件優化

1.2.6.1 單因素實驗 速效碳、氮源:該部分只考慮單一因素對發酵產蛋白酶活力的影響。主要原料鷹嘴豆粉中速效碳源含量低,擬添加速效碳源以促進菌體早期繁殖,并添加氮源以完善營養。分別采用單因素實驗比較碳、氮源對產蛋白酶的影響,其中麥芽糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖等碳源添加量為0.6%,豆粕粉、蛋白胨、魚蛋白胨、黃豆粉等氮源添加量為1%。接種量:為考察種子液接入量對納豆枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響,在發酵培養基中接入種子液的體積分數分別為2%、3%、5%和8%。鹽離子:為考察鹽離子對蛋白酶活力的影響,在培養基中分別加入氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀四種不同的鹽離子,添加量為0.01%。

1.2.6.2 Plackett-Burman法篩選影響產蛋白酶的重要因素 影響納豆芽孢桿菌發酵鷹嘴豆產生蛋白酶的因素有碳源、氮源、接種量、裝液量、搖瓶轉速、氯化鈣、葡萄糖、氯化鈉等,因為因子數眾多，且未確定各因子對因變量的影響程度，故采用Plackett-Burman法,以蛋白酶活力為指標篩選顯著影響發酵的因素,因素水品設計見表1。PB實驗設計中另設3個虛擬列C、F和I,以考察實驗誤差。

表1 Plackett-Burman因素及水平設計Table 1 Factors and level design of Plackett-Burman

1.2.6.3 最陡爬坡實驗 為使響應面實驗在臨近最佳數值時建立有效的響應面方程[23],爬坡實驗把變量的變化趨勢作為爬坡方向,依據各自變量的數值大小確定步長,方可快速有效地接近最高點。實驗設計見表2。

表2 最陡爬坡實驗設計Table 2 Experimental design of steepest climbing method

1.2.6.4 Box-Behnken實驗與響應面優化 根據Plackett-Burman和最陡爬坡實驗的結果,設計Box-Behnken實驗的因素與水平(見表3),以蛋白酶活力為指標,輔以納豆激酶檢測值為驗證,篩選出對液態鷹嘴豆納豆發酵影響效果最顯著的3個因素,設計3因素3水平的中心組合實驗設計[24],并與響應面優化相結合,進一步考察這三個因素不同水平下不同組合對鷹嘴豆納豆產蛋白酶能力的影響。

表3 響應面分析方法因素與水平設計Table 3 The factors and levels of response surface analysis

1.3 數據處理

實驗中每組數據重復3次,用SAS、SPSS 17.0及Excel處理數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

結果見圖1所示。不同碳源對納豆枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響見圖1(a)。添加蔗糖和淀粉不利于納豆枯草芽孢桿菌產蛋白酶,甚至有抑制作用;但麥芽糖和葡萄糖可有效促進納豆菌產蛋白酶,分別比對照組提高15%和23%,這與Gul等[25]的結果一致,即微生物最易利用單糖。據此,選用葡萄糖作為速效碳源。

不同氮源對納豆枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響見圖1(b)。添加蛋白胨和魚蛋白胨后的酶活低于對照組;添加黃豆粉后,酶活并無明顯提高;添加豆粕粉后,蛋白酶活力提高38.5%。據此,選用豆粕粉作為外加氮源。

由圖1(c)可知,當種子液接入量為2%時蛋白酶活力最高,接種量為3%和5%時蛋白酶活力有所下降,而8%時雖有升高,但仍不及2%組。其原因可能是當接入量過低時,菌體生長較慢,過高則加速消耗發酵底物。因此以2%的接種量進行后續實驗。

如圖1(d)所示,添加氯化鈣和硫酸鎂的酶活分別為832和815 U/mL,均高于對照組;添加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的蛋白酶活力分別為784 U/mL和682 U/mL低于對照組。因此選擇添加氯化鈣進行后續實驗。

2.2 基于Plackett-Burman法的培養基與發酵條件篩選結果

PB實驗設計與結果見表4,各參數及水平見表5。

表4 n=12的Plackett-Burman實驗設計與結果Table 4 The experimental design and results of n=12 Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman實驗因素、水平及其效應Table 5 Factors,levels and effects of Plackett-Burman

表5結果顯示,該PB模型極顯著(p<0.0001)。A(裝液量)與Y(蛋白酶活力)呈負相關,這是由于納豆芽孢桿菌為好氧細菌,減少裝液量可增大空氣接觸面,提高溶氧量。同理,B(轉速)與蛋白酶活力呈正相關。D(鷹嘴豆粉添加量)作為主要碳氮源,為菌體生長繁殖提供營養,且與Y呈顯著正相關;E(豆粕粉)對Y有較小的影響,可能因為鷹嘴豆本身富含蛋白質,但豆粕粉中大豆蛋白的小分子物質起到前期誘導的作用[26]。此外,J(葡萄糖)、K(氯化鈉)對結果無顯著影響,為避免其效應是在影響更大因素的存在下被忽略,因此二者的添加量保持不變;H(接種量)對結果有負效應,可能由于接種量較大時發酵前期菌體的生長繁殖會消耗大量營養物質,導致酶的合成過程中營養相對不足,但接種量太低會延長微生物繁殖時間,酶活高峰期延后到來,后續實驗仍保持2%的種子液接入量,該結果與Li等[27]的研究相同。由文獻知,豆粕粉、葡萄糖作為速效碳氮源,可縮短微生物的延滯期[28-29]。G(氯化鈣)在PB實驗中為負效應,本實驗以食品工業生產為方向,本著健康天然、減少添加的原則,后續實驗不添加氯化鈣。因此本實驗其余因素分別采取豆粕粉1.0%、葡萄糖0.6%、氯化鈉0.5%、接種量2%。

2.3 最陡爬坡實驗

Plackett-Burman結果表明,對鷹嘴豆納豆液體發酵影響最大的3個因素分別是裝液量、轉速和鷹嘴豆粉添加量。最陡爬坡實驗結果見表6。以逼近最大酶活區域的3號條件作為下一步實驗基準,即裝液量70 mL/500 mL、轉速230 r/min、鷹嘴豆粉含量5.5%。

表6 最陡爬坡實驗結果Table 6 The results of steepest climbing method

2.4 Box-Behnken實驗與響應面優化

在最陡爬坡實驗結果的基礎上,采取三因素三水平分析方式,并對裝液量Z1、轉速Z2、鷹嘴豆粉添加量Z3做如下變換:X1=(Z1-70)/10,X2=(Z2-230)/20,X3=(Z3-5.5)/1,以X1、X2、X3為自變量,以蛋白酶活力為響應值Y,實驗方案及結果見表7。

表7 響應面分析實驗方案及結果Table 7 Experimental program and results

通過Minitab 17對結果進行方差分析,并得到二次多項回歸擬合實驗數據:

Y=3137.20+122X1+296.38X2+53.38Z3+61.25X1X2+17.75X1X3+50X2X3-156.35X12-11.10X22-130.1X32。

由表8知,所選模型之間處理方式有顯著差異(p<0.05)。在線性影響效應中X1(裝液量)和X2(轉速)的p<0.05,說明裝液量與轉速對蛋白酶活的效應顯著,而X3(鷹嘴豆粉添加量)的效應不顯著。ATP等高能化合物為細胞生長與酶合成提供能量[30],充足的氧氣才能降解碳氮源以產生ATP,確保溶氧量是基礎。延滯期在速效碳氮源的作用下縮短之后,細胞開始分解利用非速效碳氮源。當使用較稀或較易利用的培養基時,細胞的生長往往使營養物質過早耗盡,導致微生物細胞過早自溶,使發酵產物的產量降低[31]。鷹嘴豆粉可維持培養基的濃度,不至于被過快分解。二次項系數A2影響極顯著(p<0.01),C2影響顯著(p<0.05),說明裝液量與鷹嘴豆粉添加量對蛋白酶活有重要影響,導致曲面效應顯著,具體實驗因子對響應值變化的影響較復雜。交互項的交互效應p值均大于0.05,說明兩兩交互效應不顯著。失擬項不顯著p=0.2014,模型顯著，擬合度良好。回歸方程的響應面圖見圖2。每張圖都是兩個交互因素的響應面,每個響應面都存在最高點。250 r/min已達到本實驗室搖床的最高水平,故設定250 r/min為最高轉速。

表8 Box-Behnken實驗方差分析Table 8 Variance analysis of Box-Behnken

圖2 鷹嘴豆納豆液態發酵條件的響應面圖Fig.2 Response surface of submerged fermentation condition of chickpea natto

由圖2(a)可知,蛋白酶活隨轉速的提高在250 r/min達到最高;裝液量對蛋白酶活力的影響呈現先升高后降低的趨勢,低裝液量60/500 mL易增加發酵液的蒸發,培養基底物較快消耗完畢,菌體進入穩定和自溶,而80/500 mL則溶氧降低、菌體生長密度和液體剪切力等均受影響,因此二者的響應值明顯低于70/500 mL。由圖2(b)可知,鷹嘴豆粉添加量為4.5%和6.5%時蛋白酶活力較低,而添加量為5.5%時較高,蛋白酶活力先上升后下降。鷹嘴豆粉含量決定發酵液的濃稠程度,太濃或太稀均不利于菌體生長。溶氧率更多取決于轉速,因此蛋白酶活力隨轉速的提高而明顯上升。由圖2(c)可知,在裝液量和鷹嘴豆粉添加量的交互作用下,裝液量和鷹嘴豆粉添加量對蛋白酶活力影響的趨勢相同,為先增后減,二者的交互作用明顯,并存在最高點。

SAS分析獲得最高酶活的發酵方案是裝液量76 mL/500 mL、轉速250 r/min、鷹嘴豆粉添加量5.9%,其他條件和添加量保持不變,此條件下預測的酶活是3501.1 U/mL。該模型的驗證結果是(3558.0±1.5) U/mL,誤差=1.6%±0.053%<2.0%,故該模型穩定,優化后的回歸方程適合用于納豆枯草芽孢桿菌發酵鷹嘴豆產蛋白酶活力的分析和預測。

2.5 納豆激酶的輔助驗證

隨機取多組離心處理的發酵液于纖維蛋白平板上孵育18 h之后測量溶解圈直徑。相同條件下溶解圈直徑越大,納豆激酶活力越強。纖維蛋白平板法輔助驗證Folin酚法的結果見圖3,納豆芽孢桿菌產蛋白酶活力與其納豆激酶活力趨勢基本相同,由分析可知,二者有78.1%的相關性(p=0.001),纖維蛋白平板法的驗證結果較可靠。對照培養基與優化培養基的納豆激酶溶解圈對比如圖4所示,其中對照培養基的納豆激酶溶解圈直徑為36.0 mm,優化培養基的納豆激酶溶解圈直徑為52.0 mm,后者的面積是前者的2.08倍,說明培養基和發酵條件優化后納豆激酶活力有所提高。因此在兩種方法檢測下,液態發酵的優化效果更具有說服力。

圖3 纖維蛋白平板法輔助驗證Folin酚法的參照Fig.3 The reference of Folin Phenol method by fibrin plate method

圖4 對照培養基與優化培養基的納豆激酶溶解圈對比Fig.4 Comparison of dissolved circle between control medium and optimized medium注:A為對照培養基的納豆激酶溶解圈,B為優化培養基納豆激酶溶解圈,ΦA=36 mm,ΦB=52 mm。

3 結論

在大量預實驗的基礎上篩選速效碳氮源,優化了鷹嘴豆納豆液態發酵工藝。由單因素實驗得到:添加氮源為葡萄糖,添加氮源為豆粕。在Plackett-Burman實驗基礎上得到,裝液量、轉速和鷹嘴豆粉添加量的影響最為顯著。

經優化得到鷹嘴豆納豆液態發酵的最佳培養基為:鷹嘴豆粉添加量5.9%,豆粕粉1.0%,葡萄糖0.6%,氯化鈉0.5%;培養條件:裝液量76 mL/500 mL、溫度37 ℃,轉速250 r/min,得到的蛋白酶活力為(3558.0±1.5) U/mL。相較于空白對照組,蛋白酶活力提高42.8%,通過纖維蛋白平板法的驗證,納豆激酶溶解圈面積提高了108.6%。該優化培養基提高豆粕的利用率,拓寬豆粕的利用范圍和鷹嘴豆發酵納豆的新思路,不僅培養基的營養更全面,也為后續提純納豆激酶的可能性、功能性納豆食品的研發及發酵罐的放大生產打下科學基礎。

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