山奈酚-銅配合物的合成、表征及其抗氧化活性的研究

臧永軍,陳乃富,陳存武,陳乃東,韓邦興

(1.皖西學院,生物與制藥工程學院,安徽六安 237012;2.皖西學院,中藥研究與開發工程技術研究中心,安徽六安 237012)

黃酮類化合物因具有較強的抗氧化活性而備受關注,它能夠直接清除體內自由基、抑制產生自由基的酶、螯合金屬離子、促進抗氧化因子再生和抗氧化酶的水平,是一種良好的天然抗氧化劑[1]。山奈酚作為一種常見的黃酮類化合物,廣泛存在于水果、蔬菜及中藥材中[2],近些年來研究表明,山奈酚具有抗氧化、抗癌、抗炎等多種的生物活性[3-4],在食品及醫藥保健方面具有較大的開發價值[5]。

山奈酚分子中具有超離域度和大π鍵共軛體系,分子中的羰基氧和羥基可與多種金屬離子發生強烈的配位作用[6]。通過制備金屬離子配合物以期提高其生物活性,改善其理化性質,增加其在體內的生物利用度是近些年研究的熱點[7]。大量研究表明將黃酮類化合物與人體必需金屬元素做成配合物,具有增加其抗活性氧自由基的協同作用[8],如槲皮素分別與鋅、銅、鎂等金屬離子形成的配合物在抗氧化活性上均優于槲皮素[9-11],蘆丁與桑色素分別與鉻配合后,配合物清除自由基的能力均強于其配體[12-13],而目前關于山奈酚金屬配合物的活性研究的報道還很匱乏。

鑒于山奈酚的相關藥理活性,為進一步研究其的生物活性、探索其在功能性食品及藥品研發方面的應用,本文利用山奈酚與人體必需的微量元素銅進行配合,制得山奈酚-銅(Ⅱ)配合物,并研究其在體外清除自由基的活性,為山奈酚的金屬配合物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山奈酚 99%,批號:Lot #H1519037,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二苯基苦基肼(DPPH·) 96%,批號:Lot#K1629061,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二水合氯化銅、氫氧化鈉、乙醇 均為分析純。

TU-1901型紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器設備有限公司;iS50 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司;DF-19s集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠;PHS-3S型酸度計 蕭山市分析儀器廠;FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;Q2000 DSC 差示掃描量熱儀 美國TA公司;AVANCEII超導核磁共振儀(400 MHz) 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 配合物的合成 參考文獻[6,14]方法,取0.28 g(1.0 mmol)山奈酚加入50 mL圓底燒瓶中,加10 mL的無水乙醇攪拌至溶解,再加適量氫氧化鈉,調反應液的pH為8～10。另稱取0.17 g(1.0 mmol)二水合氯化銅溶解在5 mL乙醇溶液中,將氯化銅溶液慢慢滴加到山奈酚溶液中,溶液逐漸渾濁,室溫攪拌5 h,過濾,濾餅分別用無水乙醇和水洗滌兩次。45 ℃真空干燥12 h,得到淺綠色固體粉末,置于干燥器中儲藏備用。

1.2.2 紫外光譜分析 稱取山奈酚3.6 mg,配合物4.7 mg,分別用無水乙醇溶解并定容到50 mL容量瓶中,檢測之前再稀釋20倍,用無水乙醇溶液作參比,在200～500 nm范圍掃描樣品溶液的紫外可見吸收光譜。

1.2.3 紅外光譜分析 分別取山奈酚和配合物少許,加入100倍的干燥溴化鉀,在瑪瑙乳缽研磨均勻,將混合粉末轉移到模具中,在壓片機中壓成薄片后放入樣品室,用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～500 cm-1區間范圍內掃描。

1.2.4 核磁共振分析 溶劑DMSO-d6,四甲基硅烷(TMS)為內標,測定溫度303 K,測定頻率為400 MHz,對樣品進行氫譜掃描。

1.2.5 差熱-熱重分析 在靜態空氣氣氛中,升溫速度為10 ℃/min,測定范圍為50～800 ℃條件下,對配合物進行差熱-熱重分析。

1.2.6 DPPH法抗氧化活性測試 準確稱取1 mg DPPH,用適量無水乙醇溶解后,轉入25 mL容量瓶中,用無水乙醇定容至刻度,輕搖混勻,配制成1×10-4mol/L DPPH溶液,低溫避光保存備用。以無水乙醇為溶劑,分別配制濃度為1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4mol/L的待測樣品溶液。參照文獻[9]方法,稍有改進,量取2 mL DPPH溶液,分別與2 mL不同濃度的樣品溶液混合,避光37 ℃放置30 min,在519 nm處測吸光度As。DPPH自由基清除率P計算如下:

P(%)=[1-(As-Ay)/A0]×100

式中,Ay為2 mL樣品溶液與2 mL乙醇混勻后的吸光度;A0為2 mL乙醇溶液與2 mL DPPH溶液混勻后的吸光度;As為2 mL不同濃度樣品溶液與2 mL DPPH溶液混勻后的吸光度。

1.3 數據統計分析

以上實驗均平行3次,采用Origin 8.0、SPSS 20分析軟件對實驗數據進行分析、處理,采用Chemdraw 12.0軟件繪制化學結構。

2 結果與討論

2.1 山奈酚-銅金屬化合物的表征

2.1.1 紫外吸收光譜 山奈酚及配合物的紫外光譜如圖1所示,山奈酚和配合物均有2個強吸收帶,其中山奈酚的長波區帶Ⅱ373 nm,為肉桂酰基產生,屬于π→π*電子躍遷;短波區帶Ⅰ272 nm,由苯甲酰基產生,屬于n→π*電子躍遷。而山奈酚-銅配合物的2個主要吸收帶分別是帶Ⅰ280 nm,帶Ⅱ423 nm。對比配體和配合物的2個吸收帶來看,配合物吸收帶均發生紅移,且吸收強度隨之下降。這是因為Cu2+與配體中3-OH和4-C=O形成新環,整個分子的共軛體系增長,電子的離域程度增加,致使電子躍遷時所需的能量降低,故吸收峰紅移[15]。

圖1 山奈酚(a)和山奈酚-銅配合物(b)的UV-Vis 光譜Fig.1 The UV-Vis spectroscopy of kaempferol(a)and its complex(b)

2.1.2 紅外光譜 山奈酚及配合物的紅外光譜掃描結果如圖2所示,其代表性基團遷移見表1。結果顯示山奈酚-銅配合物和山奈酚紅外圖譜相似,但吸收頻率均發生紅移。其中山奈酚的羰基(C=O)頻率1657 cm-1,形成銅配合物后紅移至1625 cm-1,這是由于山奈酚的C=O與Cu2+發生了配位,電子向氧原子移動,C=O電子云密度降低,故C=O伸縮振動向低頻移動[16]。

圖2 山奈酚(a)和山奈酚-銅配合物(b)的紅外光譜Fig.2 IR spectrum of kaempferol(a)and its complex(b)

基團C=OC=CC-O-CO-M山奈酚165716191172-配合物162515431170586

由于配合物形成了新環,增加了共軛效應,因此苯環π鍵(C=C)由1619 cm-1下降到配合物的1543 cm-1,紅移了76 cm-1;配體中的 C-O-C 形成配合物前后位置變化不大,表明它并未與金屬離子發生作用[6]。配合物在586 cm-1出現振動,為O-Cu鍵的特征峰,而該吸收峰在山奈酚的紅外波譜圖中沒有出現,再次證明Cu2+與配體發生了螯合[17]。

2.1.3 核磁共振氫譜分析 分別測得山奈酚和配合物的核磁共振氫譜,參考文獻[18],進行歸位,如表2。對比山奈酚及其配合物的核磁共振氫譜數據可得,配合物的化學位移均向高場移動,這是因為配合物的形成增加了整個分子的平面性和分子的共軛效果,且配合物中3-OH信號消失,說明此處H被Cu取代。結果與上述紫外及紅外光譜一致,進一步說明Cu2+是通過與山奈酚3-OH和4-C=O的氧原子行成配合物的。

表2 山奈酚和山奈酚-銅核磁共振氫譜數據Table 2 1H NMR data of kaempferol and kaempferol-Cu

2.1.4 差熱-熱重分析 繪制其熱重-差熱-微商熱重分析(TG-DTA-DTG)曲線圖,見圖3。由TG-DTA-DTG曲線可見,在55～242 ℃,TG曲線有個失重臺階,失重率為12.02%,對應于DTA上112 ℃出現一個小的吸熱峰,是由于配合物失去結晶水所致,推測結晶水分子數為3(理論失重率為12.28%);從300 ℃開始,配合物的分子結構逐漸被破壞而引起分解,500 ℃以后,曲線趨于平穩,推測山奈酚-銅分解完全,最后剩余19.98%(CuO理論值為18.07%)為少量C和CuO的質量,推斷配體和銅的分子數均為1。

圖3 山奈酚銅配合物的TG-DTA-DTG 曲線Fig.3 The TG-DTA-DTG curves of kaempferol-Cu

結合以上紫外光譜、紅外光譜、核磁共振氫譜及差熱-熱重的分析的數據,可以推測出合成的山奈酚銅配合物結構為:

圖4 山奈酚-銅的結構Fig.4 The chemical structure of kaempferol-Cu

2.2 山奈酚及山奈酚-銅配合物對 DPPH自由基的作用

實驗結果見圖5，分別為山奈酚和配合物在6種梯度濃度下對DPPH·的清除作用的分布圖。由圖5可見山奈酚和配合物在濃度2.0×10-4mol/L前，均是隨著濃度的增大，對DPPH·的清除率呈明顯上升趨勢，且配合物對DPPH·的清除能力顯著高于山奈酚(p<0.05)，清除DPPH·半抑制濃度(IC50)分別為1.63×10-4、1.51×10-4mol/L。當被測樣品濃度超過2.0×10-4mol/L后，二者清除率逐漸相近，無顯著差異(p>0.05)，且曲線趨于平緩，說明對DPPH·的清除已達到飽和。總體來看，形成配合物后對DPPH自由基的清除能力較配體有所提高。

圖5 山奈酚及山奈酚配合物對DPPH·的消除率Fig.5 Scavenging activities of kaempferol and kaempferol -Cu complex on DPPH radical注：不同小寫字母表示相同濃度下，不同樣品間差異顯著(p<0.05)。

這可能是因為山奈酚的多酚結構特性決定的,其抗氧化作用中是通過酚羥基與自由基反應[19]。酚羥基捕獲DPPH·的電子,并提供H原子給DPPH,使其生成穩定的DPPHH,而自身產生一種新的酚基自由基,此基團通過芳香核的自旋作用以及形成分子內氫鍵被穩定下來,使自由基氧化鏈式傳播過程被中斷,起到了清除外在自由基的作用。因此,山奈酚清除自由基活性的高低與酚基自由基的穩定性密切相關[11,20]。如圖6,形成配合物后,金屬離子能提高酚基自由基穩定性,從而增強了山奈酚的抗氧化活性。此外,山奈酚中4位C=O與Cu形成配合物后,分子的電子云分布離域,也同樣使配合物形成的酚基自由基更加穩定,因而配合物抗DPPH·的作用高于配體[21]。

圖6 山奈酚銅配合物清除DPPH自由基的機制Fig.6 The mechanism of kaempferol-Cu complex for scavenging DPPH radical

3 結論

本文合成了山奈酚-銅配合物,通過紫外、紅外、核磁共振氫譜等分析手段,對其結構進行了表征。結果表明,山奈酚是通過分子中羰基(4位)和羥基(3位)與Cu2+發生螯合。體外清除自由基實驗表明,山奈酚和山奈酚-銅配合物都具有清除自由基的能力,并且都具有一定的劑量依賴性,且山奈酚-銅配合物清除自由基的能力強于山奈酚。目前關于山奈酚金屬配合物抗氧化性的報道還比較少,本文為山奈酚金屬配合物的開發研究提供參考。

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