食源性致病菌RPA檢測技術研究進展

胡金強,魏向珂,黃潤娜,孫新城,2,景建洲,2,高 輝,2,耿 堯,2,董彩文,姜春鵬

(1.鄭州輕工業學院,食品與生物工程學院,河南鄭州 450000;2.河南省食品安全國際聯合實驗室,河南鄭州 450000;3.食品生產與安全河南省協同創新中心,河南鄭州 450000)

“民以食為天,食以安為先”[1]。食源性致病菌在全世界廣泛分布,每年導致成千上萬例人類疾病,是世界頭號食品安全問題。據世界衛生組織報道,全球每年有多達6億人因食用受到污染的食品而患病,其中有42萬人因食源性疾病死亡[2]。在眾多食源性致病菌中,尤以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等影響范圍廣泛[3],對人類身心健康產生極大危害,且造成重大經濟損失,最終導致嚴重的公共衛生安全問題。由此可見,開發食源性致病菌快速檢測技術,防控食源性疾病的發生與發展,在食品安全與公共衛生方面具有重大意義。

利用傳統檢測方法如聚合酶鏈式反應(PCR)、多重PCR、酶聯免疫吸附技術(ELISA)等檢測食源性致病菌仍存在耗時、操作繁瑣、檢測結果不準確等問題[4]。尤其是靈敏度、特異性以及實用性低等技術問題,已經嚴重制約了這些技術的推廣應用。因此,迫切需要更加靈敏、高效、快速、敏感、特異方法應用于食源性致病的檢測[5],以實現對食源性致病菌的有效監控。在這種背景下,重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase polymerase amplification,RPA)滿足了食源性致病菌檢測的技術需求,近年來得到了快速發展。本文將對RPA及其衍生技術作簡要介紹。

1 RPA技術原理與技術簡介

RPA技術是一種新型的恒溫擴增技術,反應模式與PCR相似,不同的是RPA不需要原始的加熱步驟使DNA模板變性,而是利用重組酶引物復合物掃描雙鏈DNA,進而促進DNA鏈上同源位點的互換[6]。RPA反應所需要的關鍵酶是能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、DNA單鏈結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶[7]。RPA技術原理如圖1所示[8]:a. 重組酶與長約30～35 nt的引物結合形成的復合物在雙鏈DNA模板中尋找靶位點;b. 復合物在模板上定位后可以直接引發鏈交換反應形成D狀環,SSB隨即結合被置換的DNA鏈,形成D-Loop結構,防止引物解離;c. 重組酶-引物復合物主動水解體系中的ATP導致復合物構象改變,重組酶解離后引物3′端暴露并被鏈置換DNA聚合酶識別,DNA聚合酶按照模板序列在引物3′末端添加相應堿基,DNA擴增反應啟動;d. 鏈置換DNA聚合酶在延伸引物的同時繼續解開模板的雙螺旋DNA結構,DNA合成過程繼續進行;e. 兩條引物擴增完成即形成一個完整的擴增子[8]。RPA反應不需要精確的溫度控制,所有反應步驟可在37～42 ℃完成,并且在20 min內即可達到檢測水平[9-10]。除此之外,RPA可實現對不純樣品的檢測,反應試劑可以凍干形式保存使用,不需要再以冷鏈形式儲存運輸[11]。

圖1 RPA技術原理示意圖Fig.1 Schematic of RPA principle

2 RPA及其各個衍生技術的應用

RPA作為等溫擴增技術中的后起之秀[12],結合了血清學和分子技術的優點,并克服了兩種方法的缺點,是一種簡單、快速、性價比高的診斷工具,能夠實現實驗室外的現場精確檢測[13]。并且在RPA基礎上實現了其衍生技術的應用與發展,使RPA的應用范圍更加廣泛,技術更加創新、實用。

2.1 直接重組酶聚合酶擴增技術(Direct-RPA)

Direct-RPA[14]和直接聚合酶鏈式反應(Direct-PCR)一樣[15],在不進行復雜樣品前處理步驟的情況下,在常溫下就可以進行樣品中目標基因擴增,大大簡化了整個過程分析。

Choi等[16]利用離心Direct-RPA,對被污染牛奶樣品進行檢測,以3.2 μL含有4×104個目標細菌的牛奶作為待檢樣品,以沒有被污染牛奶作為陰性對照。在檢測前用熒光基團標記目的基因。結果表明,與陰性對照相比,含菌牛奶樣品的熒光信號在反應中明顯增強,對照組則無變化。另外對細菌靈敏度也進行了檢測,培養細菌進行連續稀釋10倍,在3.2 μL牛奶中細菌細胞個數從4×104～4×100,之后進行檢測得出在3.2 μL牛奶中細菌細胞個數最低檢出限為4個細胞。此方法在30 min內可檢出牛奶中的沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌。并且,此實驗無需DNA提取步驟可直接從牛奶樣品中檢測目標食源性致病菌。

離心Direct-RPA具有很大優勢,包括無需樣品預處理步驟,反應時間短、重復性好。這些優勢賦予了離心Direct-RPA微裝置良好的現場診斷效果,可對食源性致病菌進行快速、高靈敏度、高準確度安全性檢測。然而,Direct-RPA的缺點在于需要離心機和熒光顯微鏡,在一定程度上失去了現場診斷價值。

2.2 重組酶聚合酶擴增側流層析技術(RPA-LFD)

側流層析試紙條(LFD)目前用于定性、半定量檢測的簡單裝置,用于資源貧乏或非實驗室環境[17]。RPA和LFD相結合可建立一種靈敏、特異、快速與直觀的現場跟蹤目標物的檢測系統。

RPA-LFD基于RPA擴增原理,利用帶生物素標記引物和帶羧基熒光素(FAM)標記的探針與靶核酸進行擴增反應,最終擴增產物攜帶FAM和生物素標記[18]。LFD前端包被帶FAM抗體的納米金粒,檢測線(T)上包被生物素抗體,當反應液進入試紙條時,帶有FAM和生物素的擴增產物通過抗原抗體結合作用,在檢測線上形成“生物素抗體-核酸-納米金粒”復合物顯色。質控線上包被抗FAM抗體的固定抗體,可直接與帶FAM抗體的納米金粒結合,在質控線上顯色,以確保試紙條的有效性[19-20]。RPA-LFD檢測可在15～20 min內完成,在25～45 ℃的環境中均可進行檢測,最適溫度為35～45 ℃。因此,可用一些簡單的加熱裝備,比如電熱水器甚至體溫便可實現精確檢測[9-10]。RPA-LFD檢測結果在橫向流動試紙條上顯示紅色條帶,裸眼就可觀察,即使是非專業人員也可以直接觀察分析結果,非常適用于實地檢測,特別在經濟條件差,資源不足區域更具良好的應用前景[21]。

Kim等[22]運用此方法檢測PBS緩沖液和牛奶中的沙門氏菌,RPA反應和LFD二者用一個固體裝置連接起來,在此固體裝置上裝有一個單一的激光二極管用于無線控制閥門驅動,此二極管用于細菌細胞熱裂解及等溫擴增步驟時進行的非接觸加熱,裂解后的細菌DNA溶液和RPA預混液在擴增室混合進行反應,最后樣品溶液被吸入到LFD試紙條上,5 min后裸眼觀察檢測結果。整個實驗過程在30 min內即可完成。此外,為了獲得高的檢測靈敏度,混有不同稀釋梯度沙門氏菌溶液的1 mL PBS緩沖液和1 mL牛奶在用抗體包裹的磁珠載入椎間盤之前被濃縮。實驗結果得出PBS緩沖液和牛奶中的沙門氏菌檢出限分別為10 CFU/mL和100 CFU/mL。Liu等[23]用RPA-LFD檢測牛奶和雞胸肉中的沙門氏菌,并且在靈敏度、特異性等方面進行了研究,優化了反應溫度和反應時間,和PCR-LFD進行了對比,結果顯示RPA-LFD的檢出限為1.05×101CFU/mL,而PCR-LFD的檢出限為1.05×105CFU/mL,結果表明RPA-LFD的檢出限比較低,靈敏度高。

RPA-LFD的缺點在于,RPA反應產物需要進行適度稀釋,如果稀釋不夠,容易造成假陽性結果,而且開放環境操作RPA-LFD同樣會造成該方法的假陽性結果;此外,RPA-LFD最多可進行二重食源性致病菌檢測,限制了檢測的效率。

2.3 重組酶聚合酶擴增酶聯免疫吸附技術(RPA-ELISA)

RPA-ELISA,即RPA與ELISA相結合技術。該方法進行DNA擴增可在40 ℃下、40 min左右完成反應。對于標記產品進行雜交,用特異性5′-生物素與鏈霉親和素標記的探針在包被微孔板上進行反應,在室溫下即可進行,結果可用比色法進行檢測[24-25]。

Santiago-Felipe等[24]利用RPA-ELISA技術同時檢測了榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的過敏原、轉基因啟動子-P35S、轉基因終止子-TNOS、病原菌沙門氏菌和阪崎腸桿菌以及霉菌。結果表明,每個分析物的檢出限為1.3～5.3 μg/g,病原菌菌體濃度為6～13 CFU/mL,不僅比PCR-ELISA的靈敏度與重復性高,而且RPA-ELISA技術更適合應用于邊遠地區、山區等資源缺乏環境。

除了RPA-ELISA技術,類似的等溫擴增技術和ELISA技術結合使用的還有環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[26]和解旋酶依賴性擴增(Helicase-dependent amplification,HDA)[27]。上述技術具有很多技術優點:如不需要昂貴的實驗設備,可在幾個小時內處理幾百個樣品,非常靈活方便。但是與RPA-ELISA相比,這兩種技術所需溫度或者引物條件較苛刻。比如,RPA-ELISA反應溫度在37～42 ℃即可,避免了熱循環,也不需復雜的引物設計;HDA-RPA則需要在95 ℃條件下進行變性,LAMP-ELISA需要復雜的引物設計才能完成接下來步驟[28]。除此之外,RPA-ELISA也是一種快速、低成本的半定量分析技術,在選擇性、靈敏度、重現性以及高通量等方面表現出優異的分析性能。再者,在DNA提取步驟之后,檢測過程可在2 h內進行完畢,所有樣品在只有一個擴增條件和相同檢測技術下可同時處理。

RPA-ELISA技術也存在一些缺陷,比如重復性不好,易出現假陽性,溫度和時間等實驗參數對實驗結果影響很大。

2.4 實時重組酶聚合酶擴增技術(Real-time RPA)

Real-time RPA,即實時熒光定量RPA,與Real-time PCR比較,Real-time RPA檢測結果與前者具有相同的靈敏度與特異性[29],然而Real-time RPA的檢測過程所需時間明顯短于Real-time PCR,即Real-time RPA所需時間是7～15 min,Real-time PCR則需耗時90 min[30],且與Real-time RPA相比,Real-time PCR的實驗操作設備較復雜、昂貴,而且所占空間大、不便攜帶。除此之外,Real-time PCR需要一個熱循環過程且實驗操作步驟復雜[31],而Real-time RPA實驗操作溫度在37～42 ℃的條件下便可進行,無需復雜的操作程序。

RPA擴增結果可通過實時熒光定量檢測[32]。RPA擴增的實時檢測依賴于核酸外切酶Ⅲ,它會切斷exo-探針中的四氫呋喃(THF),導致熒光基團和熒光淬滅基團的分離[33-35],擴增結果通過exo-探針檢測。此探針攜帶一個熒光基團和一個熒光淬滅基團,分別與一個胸腺嘧啶結合,中間由一個四氫呋喃(THF)堿基隔開,當此結構完整時,熒光強度低[36]。當探針與靶序列結合時,連接熒光基團和淬滅基團的THF堿基位點就會被核酸外切酶Ⅲ識別并酶解,下游的淬滅基團被釋放,熒光強度增強。酶切后產生的游離3′-OH作為DNA聚合酶的靶點并擴增此探針,熒光強度也會隨著其擴增而增強[37]。熒光強度信號實時檢測由熒光信號檢測器[38]或掃描儀[39]完成,其敏感度強、特異性強,檢測所需時間短。Kim等[40]用此方法對雞蛋、雞肉和雞湯中的結腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌進行了雙重檢測,實驗在45 ℃溫度條件下進行20 min即可完成,結果顯示在純培養物中結腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌的檢出限是1 CFU/反應,在雞湯中的檢出限是1 CFU/mL,在沒有預富集的情況下雞蛋和雞肉中的檢出限是103CFU/g,經過24 h富集培養后雞蛋和雞肉中結腸彎曲桿菌和空腸彎曲桿菌的檢出限是1 CFU/g。并且和另外33種細菌進行了特異性檢測,結果表明只有空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌是陽性,其余均為陰性。Clancy等[41]使用編碼前導肽酶作為分子診斷靶基因,利用Real-time RPA檢測全血中肺炎鏈球菌,并進行相應的實驗和優化,并且在靈敏度和檢出限方面和Real-time PCR進行對比。結果顯示兩者的靈敏度相當,均為100%,Real-time RPA的檢出限是4.0個基因組/反應,而Real-time PCR的檢出限是5.1個基因組/反應,二者檢出限也相差不是太多,但是就反應動力學而言,Real-time RPA要比Real-time PCR快得多,僅需20 min即可完成反應,而后者需要數小時。除此之外,Real-time RPA也成功實現了對弗朗西斯土拉熱桿菌[34]、B族鏈球菌[42]、布魯氏桿菌[43]以及產志賀毒素大腸桿菌[44]等的檢測(表1)。

表1 RPA技術在食源性致病菌檢測領域的應用Table 1 Application of RPA technology for the detection of foodborne pathogenic bacteria

Real-time RPA本身也具有一些缺點,例如實驗成本高,需要熒光定量設備,而且該技術容易造成交叉污染,導致假陽性結果出現。

2.5 RPA微流體

微流體是一種將樣品準備、核酸擴增及產物檢測結合于一體的集成設備,省略了準備、配制試劑的過程,已廣泛應用于分子診斷領域[37]。Hakenberg等[45]首次在微流體系統上成功實現反應試劑的被動層流混合,此系統實現了芯片微體積的試劑溶解混合,此方法促進了RPA研究朝高通量的方向發展。

Lutz等[46-47]將RPA反應與微流體芯片反應裝置系統相結合,實現實時檢測。該微流體包括液體反應劑的玻璃安瓿和凍干試劑。液體反應液包括緩沖液及鎂離子等,凍干試劑包括各種酶、引物及探針等。該系統在裝有孵育器的箔片離心裝置上設計了幾個小型反應腔室。當需要檢測時緩沖液和凍干試劑在不同的反應腔室中通過離心使兩者混合。這種自動系統可以在20 min內實現多個反應同時進行的極高靈敏度檢測,在實驗中檢測到了少于10個拷貝數的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)。Kersting等[48]把微陣列技術與多重擴增RPA相結合,在四個反應室內可同時擴增四個反應靶標,擴增子通過與熒光基團偶聯的反向寡核苷酸引物進行標記。擴增和空間分辨信號的產生依賴于環氧-硅烷化的玻璃表面結合的固定化正向引物上,此過程在泵驅動雜交室中完成。在38 ℃下,微陣列技術和RPA技術的組合允許在相當小的區域內進行多參數分析,反應在20 min內完成,實驗得出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenterica)的檢出限是10 CFU/mL,淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)的檢出限是100 CFU/mL,實現了同時檢測淋病奈瑟氏菌、腸炎沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

Tsaloglou等[49]利用微流體滑動芯片與RPA技術相結合,檢測出了艱難梭狀芽孢桿菌,芯片上RPA測定的靶向艱難梭菌毒素B基因(tcdB)編碼毒素B,編碼出的其中一種蛋白質負責細菌毒性。該裝置用透明丙烯酸制造,采用快速成型方法。它有六個重復的500 nL反應孔以及兩組500 nL對照孔,反應在此裝置上進行,用熒光探針進行實時監測。該反應在20 min內完成,實驗結果得出艱難梭狀芽孢桿菌的檢出限為1 fg。Eid等[50]在微流體芯片上等速電泳(ITP)與RPA技術相結合檢測全血中的單增李斯特菌,在微流體芯片上用ITP進行純化處理25 μL樣品量,將細菌DNA與全血污染物分離,之后將提取的DNA直接轉移到RPA預混液中進行等溫孵育和檢測。純化提取DNA和檢測所需總的時間在75 min內可以完成。實驗結果檢測出單增李斯特菌的檢出限是5×103～2×104個細胞/mL。

RPA微流體雖然集成度較高,但是研發與使用成本較高,制作與組裝程序復雜、周期長,推廣使用具有一定難度。

3 總結與展望

食品是人類賴以生存的物質基礎,食品安全是關系到社稷民生的重大問題,食源性致病菌作為食品安全問題的首要隱患,傳統檢測技術已不能滿足食源性致病菌檢測需求,因此建立快速、靈敏、特異、多重的檢測方法十分必要。RPA技術作為一個新興的分子檢測技術,到目前為止,不僅在醫學和藥學方面應用較多,而且在食源性致病菌檢測方面也開始嶄露頭角。RPA技術具有諸多技術優勢:不需要熱循環,在室溫37～42 ℃左右即可完成反應;反應時間短,只需15～20 min;攜帶方便,RPA與LFD、ELISA、熒光等技術結合可實現實地檢測和便攜式攜帶等。然而,RPA技術也有一些缺點與不足,比如RPA涉及的酶類比較昂貴、檢測對象單一、電泳檢測需對產物進行純化等。鑒于此,未來RPA將朝著經濟、高通量、多重化以及更加快速、便攜、敏感、特異的方向發展,相信在不遠的將來RPA會在食品安全檢測領域發揮重要作用。

[1]胡金強,雷俊婷,景建洲,等. 食源性致病菌PCR檢測技術研究進展[J].輕工學報,2016,31(3):49-56.

[2]劉秀梅. 食源性疾病監控技術的研究[J]. 中國食品衛生雜志,2004(1):3-9.

[3]Xu Y G,Cui L C,Tian C Y,et al. A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens[J]Food Control,2012,25(2):778.

[4]劉程,劉芳,劉箐,等. 出血性大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體制備及免疫膠體金試紙條的研制[J]. 食品與發酵工業,2014(5):199-205.

[5]舒暢,姜琛璐,鐘慈平,等. 三種食源性致病菌多重 PCR 檢測方法的建立[J]. 食品工業科技,2014,35(12):49-54.

[6]Piepenburg O,Williams C H,Stemple D L,et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS Biology,2006,4(7):e204.

[7]Li J,Macdonald J. Advances in isothermal amplification:novel strategies inspired by biological processes[J]. Biosensors and Bioelectronics,2015,64:196-211.

[8]Boyle D S,McNerney R,Low H T,et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by recombinase polymerase amplification[J]. PLoS One,2014,9(8):e103091.

[9]Lillis L,Lehman D,Singhal M C,et al. Non-instrumented incubation of recombinase polymerase amplification assay for the rapid and sensitive detection of proviral HIV-1 DNA[J]. PLoS One,2014,9:e108189.

[10]Crannell Z A,Rohrman B,Richards-Kortum R. Equipment-free incubation of recombinase polymerase amplification reactions using body heat[J]. PLoS One,2014,9:e112146.

[11]Mekuria T A,Zhang S,Eastwell K C. Rapid and sensitive detection of Little cherry virus 2 using isothermal reverse transcription-recombinase polymerase amplification[J]. Journal of Virological Methods,2014,205:24-30.

[12]吳耀東,徐民俊,鄭文斌,等. 重組酶聚合酶擴增技術及其在動物病原快速檢測中的應用[J]. 中國獸醫學報,2016,36(10):1797-1802.

[13]高威芳,朱鵬,黃海龍. 重組酶聚合酶擴增技術:一種新的核酸擴增策略[J].中國生物化學與分子生物學報,2016(6):627-634.

[14]陳斌,楊銀梅,鐘志敏,等. 重組酶聚合酶等溫擴增快速檢測結核分枝桿菌[J]. 熱帶醫學雜志,2016,16(8):955-957.

[15]Fuehrer H P,Fally M A,Habler V E,et al. Notes:Novel nested direct PCR technique for Malaria diagnosis using filter paper samples[J]. Journal of Clinical Microbiology,2011,49(4):1628-1630.

[16]Choi G,Jung J H,Park B H,et al. A centrifugal direct recombinase polymerase amplification(direct-RPA)microdevice for multiplex and real-time identification of food poisoning bacteria[J]. Lab on a Chip,2016,16(12):2309-2316.

[17]Posthuma-Trumpie G A,Korf J,van Amerongen A. Lateral flow(immuno)assay:its strengths,weaknesses,opportunities and threats. A literature survey[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,393(2):569-582.

[18]Cordray M S,Richards-Kortum R R. A paper and plastic device for the combined isothermal amplification and lateral flow detection of Plasmodium DNA[J]. Malaria Journal,2015,14(1):472.

[19]Rohrman B A,Richards-Kortum R R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA[J]. Lab on a Chip,2012,12(17):3082-3088.

[20]Jaroenram W,Owens L. Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick for discriminating between infectious Penaeus stylirostris densovirus and virus-related sequences in shrimp genome[J]. Journal of Virological Methods,2014,208:144-151.

[21]景志剛,董浩,狄棟棟,等. 重組酶聚合酶擴增技術研究進展[J].生物技術通報,2016,32(6):47-53.

[22]Kim T H,Park J,Kim C J,et al. Fully integrated lab-on-a-disc for nucleic acid analysis of food-borne pathogens[J]. Analytical Chemistry,2014,86(8):3841-3848.

[23]Liu H,Zang Y X,Du X,et al. Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid visual detection of Salmonella bacteria[J]. Journal of Dairy Science,2017,100(9):7016-7025.

[24]Santiago-Felipe S,Tortajada-Genaro L A,Puchades R,et al. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis[J]. Analytica Chimica Acta,2014,811:81-87.

[25]胡金強,雷俊婷,白艷紅,等. 食品中金黃色葡萄球菌PCR-ELISA檢測技術建立[J]. 食品工業科技,2016,37(20):63-67.

[26]Ravan H,Yazdanparast R. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method in conjunction with an enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of Salmonella serogroup D[J]. Analytica Chimica Acta,2012,733:64-70.

[27]Gill P,Amini M,Ghaemi A,et al. Detection of Helicobacter pylori by enzyme-linked immunosorbent assay of thermophilic helicase-dependent isothermal DNA amplification[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2007,59:243-249.

[28]楊粵,付博宇,張蘊哲,等. 環介導等溫擴增檢測技術的應用與方法改進[J]. 食品安全質量檢測學報,2016,7(4):1526-1530.

[29]El Wahed A A,Patel P,Faye O,et al. Detection of dengue virus in ten minutes using reverse transcription recombinase polymerase amplification assay. International Journal of Infectious Diseases[C],2014,16thICID Abstracts,21.

[30]Meir R,Maharat O,Farnushi Y,et al. Development of a real-time TaqMan? RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus in chickens,and comparison of RT-PCR and virus isolation[J]. Journal of Virological Methods,2010,163(2):190-194.

[31]Yehia N,Arafa A S,Abd El Wahed A,et al. Development of reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for avian influenza H5N1 HA gene detection[J]. Journal of Virological Methods,2015,223:45-49.

[32]Xing W,Yu X,Feng J,et al. Field evaluation of a recombinase polymerase amplification assay for the diagnosis of Schistosoma japonicum infection in Hunan province of China[J]. BMC Infectious Diseases,2017,17(1):164.

[33]Euler M,Wang Y,Nentwich O,et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Rift Valley fever virus[J]. Journal of Clinical Virology,2012,54(4):308-312.

[34]Euler M,Wang Y,Otto P,et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Francisella tularensis[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(7):2234-2238.

[35]Euler M,Wang Y,Heidenreich D,et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents[J]. Journal of Clinical Microbiology,2013,51(4):1110-1117.

[36]Wang J,Liu L,Han Q,et al. An exo probe-based recombinase polymerase amplification assay for the rapid detection of porcine parvovirus[J]. Journal of Virological Methods,2017,248:145-147.

[37]孫魁,邢微微,徐東剛.重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J].軍事醫學,2015,39(10):802-807.

[38]Xia X,Yu Y,Weidmann M,et al. Rapid detection of shrimp white spot syndrome virus by real time,isothermal recombinase polymerase amplification assay[J]. PLoS One,2014,9(8):e104667.

[39]El Wahed A A,El-Deeb A,El-Tholoth M,et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus[J]. PLoS One,2013,8(8):e71642.

[40]Kim J Y,Lee J L. Development of a multiplex real-time recombinase polymerase amplification(RPA)assay for rapid quantitative detection of Campylobacter coli and jejuni from eggs and chicken products[J]. Food Control,2017,73:1247-1255.

[41]Clancy E,Higgins O,Forrest M S,et al. Development of a rapid recombinase polymerase amplification assay for the detection of Streptococcus pneumoniae in whole blood[J]. BMC Infectious Diseases,2015,15(1):481.

[42]Clarke C,O’Connor L,Carré-Skinner H,et al. Development and performance evaluation of a recombinase polymerase amplification assay for the rapid detection of group B streptococcus[J]. BMC Microbiology,2016,16(1):221.

[43]Ren H,Yang M,Zhang G,et al. Development of a rapid recombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in blood samples[J]. Molecular and Cellular Probes,2016,30(2):122-124.

[44]Murinda S E,Ibekwe A M,Zulkaffly S,et al. Real-Time Isothermal Detection of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Using Recombinase Polymerase Amplification[J]. Foodborne Pathogens and Disease,2014,11(7):529-536.

[45]Hakenberg S,Hügle M,Weidmann M,et al. A phaseguided passive batch microfluidic mixing chamber for isothermal amplification[J]. Lab on a Chip,2012,12(21):4576-4580.

[46]Lutz S,Weber P,Focke M,et al. Microfluidic lab-on-a-foil for nucleic acid analysis based on isothermal recombinase polymerase amplification(RPA)[J]. Lab on a Chip,2010,10(7):887-893.

[47]Lutz S,Weber P,Focke M,et al. Isothermal polymerase amplification in a centrifugal microfluidic foil cartridge[J]. Procedia Chemistry,2009,1(1):529-531.

[48]Kersting S,Rausch V,Bier F F,et al. Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens[J]. Microchimica Acta,2014,181(13-14):1715-1723.

[49]Tsaloglou M N,Watson R J,Rushworth C M,et al. Real-time microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform[J]. Analyst,2015,140(1):258-264.

[50]Eid C,Santiago J G. Assay for Listeria monocytogenes cells in whole blood using isotachophoresis and recombinase polymerase amplification[J]. Analyst,2017,142(1):48-54.