藥用輔料苯甲醇細菌內毒素檢查方法學研究

陳群英，鄭馬慶

(1.南京工業大學 江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 210009；2.南京工業大學 藥學院，江蘇 南京 211816)

苯甲醇，英文名為Benzyl alcohol，是醫藥合成的重要中間體，是最簡單的含有苯基的脂肪醇。有微弱的芳香氣味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑[1-2]。苯甲醇具有中等抗菌活性，可以抑制革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母菌。而且具有麻醉、鎮痛的功效。因此可以作為藥用輔料，應用于藥膏或藥液中[3]。 苯甲醇收載于FDA《非活性組分指南》(用于注射劑，口服膠囊劑，溶液劑和片劑，局部、陰道用制劑)。在英國準許用于注射與非注射用制劑[4-5]。在應用于注射劑時，有必要對細菌內毒素含量進行測定。本研究依據《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項下“1143細菌內毒素檢查法”進行干擾試驗，建立苯甲醇的細菌內毒素檢查方法，并利用凝膠半定量法對樣品進行細菌內毒素含量檢測。

1 儀器、試劑與藥品

1.1 儀器

旋渦振蕩器 (VORJEXII)，由海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產；干式恒溫器(DC3A)，由南京三愛斯技術開發有限公司生產；電熱鼓風干燥箱(DGF30)，南京市實驗儀器廠生產；移液器(1000μL、100μL)，Eppendorf。

1.2 藥品

苯甲醇，批號100-51-6，純度99.99%，密度1.047 g/mL，由湖北綠色家園精細化工股份有限公司生產。

1.3 試劑

細菌內毒素工作標準品(WSE)，規格80EU/支，批號150601-201681，由中國藥品生物制品檢定所生產；細菌內毒素檢查用水(BET)，批號1504200，規格5 mL/支，由湛江博康海洋有限公司生產；鱟試劑1(TAL1),規格0.1 mL/支，靈敏度0.125 EU/mL，批號 1503201，由湛江安度斯生物有限公司生產；鱟試劑2(TAL2),規格0.1 mL/支，靈敏度0.125EU/mL，批號1412010，由湛江博康海洋生物有限公司生產。

2 試驗方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

參照《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項下“1143細菌內毒素檢查法”進行，將兩個廠家、兩批鱟試劑(標示靈敏度均為0.125EU/mL)進行靈敏度復核試驗，結果表明鱟試劑靈敏度符合要求，測定靈敏度均為標示靈敏度。結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗

2.2 細菌內毒素限值L

根據公式L=K/M，其中K為人用每千克每小時可接受的最大細菌內毒素劑量，其中注射劑為5EU/(kg·h)。M為供試品每千克每小時的最大劑量。根據世界衛生組織規定人體每日攝入苯甲醇最高為5 mg/kg。根據公式計算得苯甲醇內毒素限值L為1EU/mg。

2.3 最大有效稀釋倍數MVD

本研究選用靈敏度為0.125EU/mL鱟試劑，根據公式MVD=cL/λ，計算當λ為0.125EU/mL時，液體注射劑c取1，MVD為8000倍。

2.4 干擾試驗預實驗

取苯甲醇，用細菌內毒素檢查用水分別稀釋50、100、250、500、1000倍，苯甲醇終濃度分別為20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，將此系列濃度的溶液記為NPC；用含0.25EU/mL(2λ)的檢查用水將苯甲醇稀釋50、100、250、500、1000倍，苯甲醇終濃度分別為20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，且含0.25EU/mL的細菌內毒素，將此系列濃度的溶液記為PPC。

取靈敏度為0.125EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC、PPC進行反應，每一濃度重復兩管，并設置陽性和陰性對照。結果見表2。

表2 干擾實驗預實驗

試驗結果表明，苯甲醇在稀釋至濃度4.188 mg/mL(此時對應苯甲醇稀釋倍數為250倍)及以下時，對兩個廠家鱟試劑均無抑制作用。

2.5 干擾試驗

用細菌內毒素檢查用水將苯甲醇稀釋成終濃度為2.094mg/mL(稀釋500倍)的供試品溶液。用細菌內毒素檢查用水(BET)和終濃度為2.094mg/mL的供試品溶液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.25、0.125、0.06、0.03EU/mL的溶液(分別稱為BET系列以及樣品系列)，參照《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項下“1143細菌內毒素檢查法”進行，并設置供試品溶液及BET陰性對照。結果見表3。

表3 干擾試驗測定結果(λ=0.125)

試驗結果表明，用兩種廠家的鱟試劑，Es均為1λ，Et均為1Es，符合中國藥典對細菌內毒素檢查有效性(0.5λ

2.6 苯甲醇樣品檢測

采用凝膠半定量實驗方法測定。用細菌內毒素檢查用水將苯甲醇(批號100-51-6)稀釋成終濃度為2.094 mg/mL的供試品溶液。按表4進行檢測。

表4 苯甲醇凝膠半定量細菌內毒素檢測結果

結果表明，苯甲醇細菌內毒素<0.06EU/mg。

3 討論

1968年Bang和Levin[6]發現鱟血凝聚機制，并建立用鱟試劑檢測細菌內毒素的檢測方法,經過世界各國研究人員的不懈努力，利用鱟血檢測藥品的細菌內毒素得到了廣泛的應用和發展。該法具有經濟、簡便、快速、特異性強及靈敏度高等優點，逐漸取代了傳統的家兔熱源測試法，現在各國藥典已收載了凝膠法和廣度法用于細菌內毒素檢測[7]。鱟試劑的最適反應pH

值一般為6.0～8.0，過酸或者過堿會對反應起干擾作用。此外，一些干擾因子如脂多糖等也會產生干擾出現假陽性反應[8-9]。因此，在實際的應用中，需排除干擾，進行方法可行性研究。本研究利用逐步稀釋法，建立苯甲醇的細菌內毒素檢測方法。結果表明，苯甲醇在濃度為10.47 mg/mL及以上時，會對反應起干擾作用，而繼續稀釋至4.188mg/mL時，干擾消除。為保險起見，選用2.094 mg/mL，進行干擾試驗。試驗結果表明，苯甲醇在濃度為2.094 mg/mL時對兩個廠家的鱟試劑均無干擾作用。利用凝膠半定量法進行苯甲醇內毒素含量測定，測得苯甲醇細菌內毒素小于0.06EU/mg，符合規定。

[1]易 巧,劉旭平,張銀花.藥用輔料苯甲醇新版藥典微生物限度檢查適用性試驗[J].中國醫學創新2017,14(4):48-52.

[2]廖 彬,劉雁鳴,龍海燕,等.氣相色譜法測定藥用輔料苯甲醇的有關物質[J].中國藥師,2015,18(8):1315-1319.

[3]吳鑫干,李陵嵐.苯甲醇制造方法[J].工業催化,2002,10(2):26-32.

[4]姚 靜.輔料應用指南[M].北京:中國醫藥科技出版社,2011:157-159.

[5]Raymond C Rowe,Paul J Sheskey,Marian E Quinn.Handbook of Pharmaceutical Excipients [M].6th Edition.London Chicago: the Pharmaceutical press and the American Pharmacists Association,2009: 64-66.

[6]Levin J,Bang F B.Clotlable protein in limulus:its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh,1968,19:186-189.

[7]王 莉,高 華,蔡 彤,等.鱟試劑的研究與應用進展[J].藥物分析雜志,2007,27(6):938-942.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典藥典2015年版(四部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:154-157.

[9]王麗華.艾迪注射液細菌內毒素檢查方法探討[J].生物技術通訊,2011,22(6):870-872.

(本文文獻格式：陳群英，鄭馬慶.藥用輔料苯甲醇細菌內毒素檢查方法學研究[J].山東化工,2018,47(7):68-69,72.)