組織工程肌腱種子細胞、支架材料和生長因子的研究進展

孫銀鳳 張國榮

【摘要】 組織工程肌腱作為肌腱損傷修復的重要方法，已成為研究熱點。本文以“組織工程肌腱、種子細胞、支架材料、生長因子”為主題詞，檢索CNKI的相關文獻。納入具有原創性、論點論據可靠的實驗文章，排除重復性研究，選擇符合標準的40篇文獻進行分析。對種子細胞的種類、支架材料的選擇以及誘導肌腱形成因素進行闡述，促進每個關鍵點的優化，以利于組織工程肌腱的成熟構建。

【關鍵詞】 組織工程肌腱； 種子細胞； 支架材料； 生長因子

【Abstract】 Tissue engineered tendon has become a key approach to repair tendon injury.Consequently，the study on it is gaining more and more popularity.“Tissue engineered tendon，seed cell，scaffold material， growth factor” are inputted as the Chinese search words in CNKI to retrieve relevant literature.On this basis，the original experimental articles， in which the arguments and opinions are reliable，that can be further analyzed amounts to 40.Surely，this number excludes the overlapping ones.Based on the types of seed cells，the selection of scaffold materials，as well as the elaboration to the factors that induce the forming of tendons，this research aims at promoting the optimization of each key point，which is conducive to the mature building of the tissue engineered tendons.

【Key words】 Tissue engineered tendon； Seed cells； Scaffold materials； Growth factor

First-authors address：The School of Clinical Medicine，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.04.039

肌腱位于肌肉與骨骼之間，起力的傳導作用。肌腱內細胞、血管較少，含大量縱行排列的膠原纖維。肌腱損傷在臨床屬常見疾病，損傷后愈合較慢，很難恢復到正常肌腱一樣的抗拉伸強度。傳統移植治療因存在移植物來源有限，免疫排斥等問題，修復效果不理想。組織工程肌腱為肌腱損傷修復提供了一種新方法，其是將種子細胞種植于支架材料上，體外培養后移植到缺損部位，隨著支架材料的降解，細胞外基質的分泌，形成新的肌腱組織，達到生物意義上的完全修復。

1 種子細胞

1.1 自體肌腱細胞 肌腱細胞作為肌腱組織固有細胞，是人們首先想到的組織工程肌腱種子細胞。1971年，Jimenez等[1]成功在體外培養雞胚腱細胞，此后，對肌腱細胞的研究逐漸深入。張兆鋒等[2]體外培養成年家雞肌腱細胞，種植于支架材料，回植于家雞體內，培養出大體、組織學結構均與正常肌腱相似的組織。但肌腱細胞增殖能力較差，尤其是在體外培養環境下，經數次傳代，細胞逐漸老化。楊志明等[3]發現類胰島素生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）能加速肌腱細胞mRNA轉錄和蛋白質合成。肌腱細胞如能獲得穩定的增殖能力則可以成為組織工程肌腱種子細胞。

1.2 間充質干細胞 間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）具有多向分化潛能，可以向骨、軟骨、肌腱、脂肪等組織分化，其易擴增數量，可以多次傳代并保持分化能力。Dressler等[4]取同一兔不同年齡時期的MSCs種植于Ⅰ型膠原支架，并回植于兔體內，結果顯示所形成的肌腱樣組織在組織學及力學性能方面都無明顯差異，證明MSCs的增殖分化能力不受供體年齡限制。曲彥隆等[5]研究表明給予MSCs應力刺激能夠加速細胞的生長繁殖。姜任武等[6]將培養的MSCs種植于生物材料上，將此復合物回植于跟腱缺損部位，8周后發現移植物與受體肌腱連接完好，不形成瘢痕。因此，MSCs可以作為組織工程肌腱的種子細胞。

1.3 皮膚成纖維細胞 皮膚成纖維細胞與肌腱細胞均起源于中胚層，它取材方便、擴增能力強，具備成為組織工程肌腱種子細胞的可能。有實驗體外培養肌腱細胞與成纖維細胞，對它們的生物學特性進行對比分析。兩種細胞未貼壁前均呈圓形，貼壁后呈梭形或多邊形。貼壁后肌腱細胞群體大致趨于一致，成纖維細胞排列呈不規則狀態[7]。董志寧等[8]實驗發現，皮膚成纖維細胞能很好地貼附于支架材料生長，但在增殖過程中，排列紊亂，修復部位易出現骨化。肌腱細胞合成Ⅰ型膠原，成纖維細胞合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原。如果能對成纖維細胞進行改造，使之成為組織工程肌腱的種子細胞，則能解決種子細胞來源不足的問題。

2 支架材料

2.1 天然高分子材料 天然高分子材料，主要有膠原、蠶絲和小腸黏膜下層（Small Intestinal Submucosa，SIS）。他們具有天然可降解性，一般都無毒，親水性及細胞親和性良好，但缺點是力學性能差、降解速度快、加工性能差[9]。

膠原由粗大的膠原纖維束平行排列而成，其方向與所受牽引力一致，具有良好的力學性能。膠原蛋白抗原性低、生物相容性好，可參與組織的愈合過程，是一種較理想的組織工程肌腱支架材料。

蠶絲具有獨特的機械性能，其支鏈有生長和黏附因子，在醫療領域獲得廣泛應用。田旭等[10]以羅曼雞的胚胎腱細胞和蠶絲構建組織工程肌腱，將其移植到肌腱缺損部位，在不同時間點做組織學、生物力學等檢查，結果表明蠶絲對肌腱細胞吸附明顯，生物相容性好，具備良好力學性能，可能會在肌腱損傷修復方面發揮巨大潛能。

小腸黏膜下層主要成分為細胞外基質，親水性強，利于細胞從培養體系中攝取營養[11]。它對局部微環境具有應答性，能促進組織重建，是一種適合細胞遷移、生長和增殖的良好支架材料[12]。它還含有多種生長因子，如成纖維細胞生長因子-2（Fibroblast growth factor-2，FGF-2）。這些生長因子在促進種子細胞增殖、細胞外基質分泌和工程化組織塑形中發揮著重要作用。劉忠玉等[13]將培養的肌腱細胞接種在SIS上，形成細胞-支架復合物，并將其回植于肌腱缺損處，結果顯示SIS具有良好的生物相容性。郭平等[14]實驗證實小腸黏膜下層對肌腱細胞無毒，細胞黏附性良好，但抗拉強度較弱。孫文才等[15]利用豬小腸黏膜下層和羅曼雞的雞胚趾深屈肌肌腱細胞聯合構建組織工程肌腱，并將其移植到成年羅曼雞的肌腱缺損部位，植入后3、6、9周檢測植入材料的最大拉伸強度優于單純小腸黏膜下層。

2.2 人工合成高分子材料 目前，組織工程肌腱常用的人工合成高分子材料主要有聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（PLGA）3種，它們的優點是來源廣、易加工、可降解，缺點是細胞親水性差，細胞附著力差等問題。

郭正等[16]對PGA和PLA進行體外降解和細胞接種實驗，結果顯示PGA適合細胞黏附和增殖，但降解速度較快；PLA降解速率較慢，但細胞不能在支架上較好黏附和增殖。因此，兩者單獨使用受到限制，要想滿足細胞的增殖黏附和支架降解過程中的力學要求，可以將PGA與PLA共聚，得到機械性能好，柔韌性好，降解速度可控的組織工程肌腱支架。

2.3 復合材料 由于天然材料和人工合成材料均具有明顯局限性，復合材料則可結合二者優勢，改進材料性能。龍劍虹等[17]將MSCs接種于膠原-PGA復合材料上，在體外構建組織工程肌腱并觀察細胞生長，發現細胞呈梭形，能適應材料伸展，沿支架材料大致平行排列。

3 生長因子

3.1 堿性成纖維細胞生長因子 堿性成纖維細胞生長因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）是重要的有絲分裂促進因子，肌腱愈合過程中bFGF能有效促進細胞增殖，誘導間充質干細胞向肌腱細胞定向分化[18]。Sahoo等[19]將bFGF與蠶絲支架復合，再與間充質干細胞進行復合培養，3周后觀察到間充質干細胞增殖明顯，生物力學性能明顯優于未復合bFGF的對照組。研究發現bFGF對損傷肌腱的重塑及提高生物力學強度方面具有重要作用[20]。但它有加重肌腱粘連的傾向，可能與鞘內肌腱細胞的膠原分泌有關，具體機制尚在研究中[21]。

3.2 骨形態發生蛋白12 骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）是一組疏水性酸性蛋白，其中骨形態發生蛋白12（BMP-12）與骨形成無關，但具有誘導間充質干細胞向肌腱和韌帶組織分化的能力。正常肌腱的腱鞘內膜及血管周圍組織中均可檢測到BMP-12。付文玉等[22]研究表明，肌腱損傷早期，BMP-12能促進缺損組織周圍腱細胞增殖，膠原蛋白合成旺盛。蔡榮輝等[23]將培養的家兔MSCs經BMP-12誘導分化，接種至Ⅰ型膠原-PGA上，并回植于肌腱缺損處，發現經BMP-12處理的MSCs，細胞增殖明顯加快，并向肌腱細胞分化，進一步證實了BMP-12可作為誘導干細胞向肌腱細胞分化的誘導因子。

3.3 轉化生長因子β 轉化生長因子β（Transforming Growth Factor β，TGFβ）是一組多功能蛋白多肽，含TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者在肌腱韌帶損傷修復中扮演不同角色。其中，TGF-β1在體內分布廣泛，能有效促進損傷肌腱韌帶的修復，是目前研究的熱點。但TGF-β1是韌帶平滑肌肌動蛋白ɑ（ɑ-SMA）分泌的信號分子，激活該信號通路能促進成纖維細胞分化，引起組織纖維化，瘢痕及粘連的形成[24]。有研究顯示，肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）能顯著減少TGF-β1誘導的ɑ-SMA表達，可以防治肌腱損傷修復過程中的瘢痕粘連問題[25]。

組織工程是近年來迅速發展的一個嶄新領域，經國內外學者的不斷研究，取得了令人矚目的成就。組織工程肌腱的發展，為臨床肌腱損傷修復帶來曙光，但目前仍存在許多問題。

種子細胞來源有限，如何實現大量穩定擴增；異體細胞如何減輕免疫排斥反應；細胞在支架材料上的黏附、增殖和分化；細胞增殖與支架材料降解同步化；天然材料力學強度差，合成材料降解過程中局部酸性產物蓄積；構造模擬人體的三維張力環境；如何適時、適量地運用生長因子，采用多種生長因子時如何發揮其協同作用等問題都有待進一步研究。

參考文獻

[1] Jimenez S A，Dehm P，Prockop D J.Further evidence for a transport from of collagen.Its extrusion and extracellular conversion to tropocollagen in embryonic tendon[J].FEBS Lett，1971，17（2）：245-248.

[2]張兆鋒，商慶新，曹誼林.自體組織工程化肌腱預制的初步研究[J].中華手外科雜志，2002，18（2）：125-127.

[3]楊志明，項舟，鄒立群.類胰島素生長-1作用下肌腱細胞的周期改變[J].中國修復重建外科雜志，1997，11（5）：296.

[4] Dressler M R，Butler D L，Boivin G P.Effects of age on the repair ability of mesenchymal stem cells in rabbit tendon[J].J Orthop Res，2005，23（2）：287-293.

[5]曲彥隆，楊衛良，孟祥文，等.梯度降解軟骨支架材料應力刺激下與骨髓基質干細胞復合三維培養的實驗研究[J].中國矯形外科雜志，2006，14（10）：772-774.

[6]姜任武，王漢群，周昌寧，等.兔骨髓間質干細胞組織工程化肌腱模型的構建[J].中南醫學科學雜志，2008，36（3）：378-381.

[7]張前法，楊志明，彭文珍，等.兔肌腱細胞與成纖維細胞生物學特性研究[J].中國修復重建外科雜志，1997，11（1）：46-48.

[8]董志寧，孫奮勇，潘秋輝，等.rhbFGF轉染人皮膚成纖維細胞的研究[J].生物醫學工程研究，2004，34（1）：33-37.

[9]譚貢霞，張允蚌.組織工程化肌腱應用于肌腱運動損傷的修復：研究與應用現狀[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（12）：2225-2228.

[10]田旭，張福江，闞世廉.蠶絲組織工程肌腱修復肌腱缺損的實驗性研究[J].中國矯形外科雜志，2010，18（4）：316-318.

[11] Hodde J，Janis A，Hiles M. Effects of sterilization on an extracellular matrix scaffold：partⅡ.Bioactivity and matrix interaction[J].J Mater Sci Mater Med，2007，18（4）：545-550.

[12]邱軼偉，朱理瑋.生長因子對肌腱細胞表型及分化的影響[J].醫學綜述，2011，17（16）：2013-2015.

[13]劉忠玉，闞世廉，李秀蘭，等.豬小腸黏膜下層作為組織工程肌腱支架材料的實驗研究[J].天津醫藥，2010，38（11）：993-995.

[14]郭平，周強，宋磊，等.小腸黏膜下層作為肌腱組織工程支架的評價[J].解放軍醫學雜志，2010，35（2）：159-163.

[15]孫文才，李玉成，李博，等.豬小腸黏膜下層作為組織工程肌腱支架的強度[J].中國組織工程研究，2012，16（29）：5361-5365.

[16]郭正，張佩華.PGA與PLA纖維性能分析及其支架設計[J].河南科技大學學報，2012，33（6）：11-14.

[17]龍劍虹，祁敏，黃曉元，等.膠原一聚羥基乙酸與骨髓間質干細胞的細胞相容性研究[J].中國醫師雜志，2005，7（2）：203-205.

[18] Sahoo S，Ang L T，Goh J C，et al. Growth factor delivery through electro spun nano fibers in scaffolds for tissue engineering applications[J].Biomed Mater，2010，93（4）：1539-1550.

[19] Sahoo S，Toh S L，Goh J C.A bFGF -releasing silk/ PLGA -based bio hybrid scaffold for ligament/tendon tissue engineering using mesenchymal progenitor cells[J].Biomaterials，2010，31：2990-2998.

[20] Oryan A，Moshiri A.A long term study on the role of exogenous human recombinant basic fibroblast growth factor on the superficial digital flexor tendon healing in rabbits[J].Musculoskelet Neuronal Interact，2011，11（2）：185-195.

[21]盛加根，曾炳芳，姜佩珠.外源性堿性成纖維細胞生長因子對鞘內肌腱愈合和粘連的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（7）：9177-9180.

[22]付文玉，路艷蒙，喬東訪，等.BMP12基因和間充質干細胞修復兔跟腱缺損的形態學研究[J].解剖科學進展，2003，9（4）：289-293.

[23]蔡榮輝，劉康.骨形態發生蛋白12誘導骨髓間充質干細胞構建組織工程肌腱[J].中國組織工程研究，2013，17（27）：4941-4950.

[24] Smith CA，Stauber F，Waters C，et al.Transforming growth factor-beta following skeletal muscle strain injury in rats[J].

J Appl Physiol，2007，102（2）：755-761.

[25]姜大朋，李昭鑄，蔣志濤，等.肝細胞生長因子阻抑TGF-β1誘導大鼠韌帶成纖維細胞ɑ-SMA過表達及其機制[J].中國康復醫學雜志，2009，24（10）：906-909.

（收稿日期：2017-11-09） （本文編輯：周亞杰）