YSY16酵母在降低陶融型原酒高級醇含量中的應用研究

李建民，韓素娜，晏 麗，楊方玉，喬艷明

（1.河南仰韶酒業有限公司，河南澠池472400； 2.漢中職業技術學院藥學與醫學技術系，陜西漢中723000；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214000）

高級醇是一元醇中分子式含碳原子數大于2的一類醇的統稱，是白酒中重要的呈香物質，它能夠增加白酒的協調感和飽滿感[1]。但在高度原漿酒降度過程中，高級醇是導致白酒出現白色渾濁物的主要原因，另外高級醇因碳鏈長分子量大導致其在人體內代謝緩慢，會促使人的大腦充血和神經中毒，也就是人們俗稱的“上頭”[2-3]。目前，國內許多酒廠都在研究如何降低原漿酒中高級醇的含量，有關降低高級醇的研究一般通過優化生產工藝、添加酶制劑和酵母等3種途徑。李長文等[4]通過正交試驗優化蛋白酶、糖化酶和干酵母的添加量，高級醇在固態白酒中生成量降低48%；宗緒巖等[5]通過控制添加生物制劑的比例，使濃香型白酒高級醇生成量降低21.06%；孫金旭[6]通過優化糖化酶的添加量，使醬香型白酒的高級醇總含量降低了48.28%，而目前國內有關陶融型白酒高級醇的研究尚無報道。

仰韶陶融型白酒作為我國第十三種香型白酒[7]，以其“醹、雅、融”的口感而被廣大消費者喜愛，而有關陶融型原漿酒中的高級醇研究還是空白。原漿酒在生產過程中高級醇主要是通過2條途徑產生，一是在酵母繁殖過程中分解氨基酸代謝形成的Ehrlich途徑，一是以葡萄糖為基質的合成路線即Harrsi途徑[8-9]。本研究基于酵母Ehrlich代謝途徑，以河南仰韶酒廠自主分離的YSY16酵母菌株為試材，制備純種酵母麩曲，考察酒醅中麩曲的不同添加量對原漿酒中高級醇含量的影響，以期得到一種陶融型原漿酒中高級醇含量的有效調控方法，為仰韶陶融型白酒的生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

菌株：YSY16酵母菌，仰韶酒業釀酒微生物實驗室（該菌株的分離、鑒定在參考文獻[7]中已發表，被鑒定為釀酒酵母）。

酒醅（河南仰韶酒業有限公司）：用取樣袋，從仰韶酒廠陶融車間獲取蒸餾過酒的酒醅。

1.1.2 主要試劑

試劑：乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇（GR，上海生物工程有限公司）。

60%乙醇溶液配制：精確量取色譜標準品乙醇60 mL，用超純去離子水定容至100 mL容量瓶。

標準溶液配制：分別精確量取色譜標準品正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇各0.20 mL，用60%vol乙醇溶液定容至1000 mL容量瓶。

內標溶液配制：精確稱取標準品乙酸正丁酯2.0 mL，用60%vol乙醇溶液定容至100 mL容量瓶。

1.1.3 儀器設備

Thermo Scientific Trace1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛世爾科技公司；MJX-250生化培養箱，杭州匯爾儀器設備有限公司；eppendorf移液器，Eppendorf公司；12 L304不銹鋼蒸餾器，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；等。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣相色譜-質譜分析條件[10-11]和樣品檢測

色譜柱：毛細管柱DB-FFAP（60.0 m×0.25 mm×0.25 mm）；程序升溫：起始溫度50℃，保持8 min，然后以5℃/min升溫到230℃,保持15 min；載氣為N2，流速0.6 mL/min，進樣口溫度220℃，檢測器溫度230 ℃，分流比 33∶1，進樣 1 μL。質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質量范圍20～550 u，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

樣品檢測：吸取200 μL內標乙酸正丁酯溶液，置于10 mL的容量瓶中，用每一酵母添加量梯度的酒樣定容，充分混勻，取混合酒樣/內標溶液1 μL于色譜進樣瓶中，氣質聯用儀測定。

1.2.2 標準曲線的繪制[12]

用移液器分別吸取正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇的標準溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，每一容量瓶中均加入內標乙酸正丁酯溶液200 μL，充分混勻，然后用60%vol乙醇溶液定容，取各濃度下混合標樣/內標溶液1 μL于色譜進樣瓶中，氣質聯用儀測定，各標樣溶液濃度結果見表1。

1.2.3 樣品實驗發酵

純種YSY16菌株麩曲制備：將培養好的液態純種YSY16菌株，接種于卡氏罐，30℃恒溫培養5 d，卡氏罐中培養好的YSY16菌株全部接種于蒸汽滅菌的麩曲中培養。采用梯度稀釋法，對培養好的純種YSY16菌株麩曲檢測菌株數量，菌株數量達到108為合格標準麩曲。

表1 標準溶液濃度 (g/L)

實驗樣品發酵：取車間配制好的酒醅，每份稱取2000 g，并在每份中添加檢測合格的純種YSY16菌株麩曲，按照0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的比例，每一梯度平行3次，攪拌均勻后分別裝入2 L發酵瓶中，密封發酵瓶，置于生化培養箱中。培養箱設置條件：起始溫度18℃，以2℃/d的條件保持升溫9 d，升溫到頂溫36℃，頂溫保持7 d，再以1℃/d的條件保持降溫12 d，使培養箱溫度達到24℃，發酵周期為28 d，確保酒醅在實驗室培養箱中發酵條件和周期與生產車間保持一致。

蒸餾取酒：將發酵好的酒醅取出來，置于不銹鋼蒸餾器中，在蒸餾取酒過程中注意根據蒸汽情況添加酒醅，注意冷卻水的溫度。

2 結果與分析

2.1 正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇的標準曲線

將1 μL標準品/內標混合物通過氣相質譜聯用儀檢測，整理所獲得數據，以標準品濃度比內標乙酸正丁酯的濃度為X（C/Ci）軸，以標準品峰面積比內標品峰面積為Y（A/Ai）軸，建立標準曲線，結果見圖1。

圖1中A為正丙醇標準曲線圖，其標準方程為y=0.8652x-0.0029，R2值0.9962；圖1中B為正丁醇標準曲線圖，其標準方程為y=1.2826x-0.015，R2值0.9989；圖1中C為異丁醇標準曲線圖，其標準方程為y=1.2422x+0.0069，R2值0.9978；圖1中D為異戊醇標準曲線圖，其標準方程為y=1.1665x+0.0697，R2值0.9979。4條標準曲線的相關系數均在兩個9以上，線性關系接近1，符合標準曲線要求，可以用于實驗數據分析。

2.2 實驗蒸餾酒中4種高級醇的氣相質譜檢測

將實驗室模擬發酵瓶中的酒樣，通過氣質聯用儀測定，結果見圖2。

由圖2可知，實驗室模擬發酵蒸餾獲得酒樣可以檢測到這原酒中常檢查的1種樣品，其正丙醇的保留時間為2.633 min，異丁醇的保留時間為3.991 min，正丁醇的保留時間為5.276 min，異戊醇的保留時間為8.630 min。

2.3 不同酵母添加量對4種高級醇產量的影響

2.3.1 不同酵母添加量對正丙醇產量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養箱中發酵，發酵結束后，獲得陶融型實驗酒樣，經氣相質譜聯用儀檢測，酒樣中正丙醇產量結果見圖3。

圖1 高級醇標準曲線

圖2 氣相質譜檢測結果

圖3 不同酵母添加量對正丙醇產量變化的影響

由圖3可知，正丙醇產量在前期隨著酵母添加量的增加明顯減少，可能是減少發酵前期酒醅中酵母菌的增殖倍數，增加了對氮源的消耗量，對Ehrlich途徑機制起到了反饋性抑制。當酵母添加量達到1.50%的比例時，正丙醇產量最低，為0.394 g/L，正丙醇的減少量達到了76.8%。因此，酵母添加量為1.50%，陶融型酒中的正丙醇含量最低。

2.3.2 不同酵母添加量對正丁醇產量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養箱中發酵至結束，獲得陶融型實驗酒樣，經氣相質譜聯用儀檢測，酒樣中正丁醇產量結果見圖4。

由圖4可知，當酵母添加量達到2.0%時，正丁醇產量最低。當酵母添加量在0.5%～2.0%時，正丁醇產量明顯減少，當酵母添加量在2.50%時，正丁醇產量開始增加。因此，酵母添加量為2.0%，陶融型酒中的正丁醇產量最低。孫金旭等[13]的研究發現，添加酵母菌后，正丁醇產量就會明顯下降，下降比例達到165%，而本研究發現，在酵母添加量為0%～2%時，正丁醇產量緩慢下降，酵母菌添加量超出2%時，正丁醇產量反而上升。

圖4 不同酵母添加量對正丁醇產量變化的影響

2.3.3 不同酵母添加量對異丁醇產量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養箱中發酵至結束，獲得陶融型實驗酒樣，經氣相質譜聯用儀檢測，酒樣中異丁醇產量結果見圖5。

圖5 不同酵母添加量對異丁醇產量變化的影響

由圖5得知，在酵母添加量為1.0%時，異丁醇產量最低，比沒有添加酵母時的異丁醇產量降低了72.2%。當酵母添加量大于1.0%以后，異丁醇產量開始顯著增加。因此，酵母添加量為1.0%，仰韶陶融型酒中的異丁醇產量最低。相比朱靜等[14]對原酒中異丁醇的降解的研究，本研究的優點在于添加酵母菌的方法更加適用于生產，并且還能增加酒醅中酵母菌的含量，可增加酒醅的活力，更加有利于提高原酒產量。

2.3.4 不同酵母添加量對異戊醇產量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養箱中發酵至結束，獲得陶融型實驗酒樣，經氣相質譜聯用儀檢測，酒樣中異戊醇產量結果見圖6。

式（1）中，被解釋變量inboundit表示i地區t時期入境旅游人次的對數；policyit是政策虛擬變量，如果樣本屬于處理組（實施過境免簽政策地區）取值為1，相反，如果樣本屬于對照組（未實施過境免簽政策地區）取值為0；timeit為時間虛擬變量，政策實施前取值為0，政策實施后取值為1；Xit為控制變量；αi和γt分別表示個體效應和時間效應；Vit為隨機干擾項。PSM-DID方法重點關注估計系數β3，衡量的是過境免簽政策的凈效應，即過境免簽政策對入境旅游的促進作用。

圖6 不同酵母添加量對異戊醇產量變化的影響

由圖6可知，當酵母添加量為1.50%時，異戊醇產量為最少，比未添加酵母的異戊醇產量降低0.469 g/L。孫金旭[15]對醬香型白酒中異戊醇的產量研究中得到酵母添加量為2.0%時，異戊醇產量最低，這和本次實驗結果不同，因為陶融型原漿酒在生產工藝和酒曲的使用方面與醬香型都不同。因此，酵母添加量為1.50%，仰韶陶融型酒中的異戊醇產量最低。

2.4 生產檢驗

通過實驗室模擬發酵結果為依據，當酵母添加量為1.50%時，總高級醇產量最低為1.133 g/L，所以在生產車間額外添加1.50%培養成熟的純種YSY16菌株麩曲。通過窖池發酵蒸餾取酒，經GC-MS檢測陶融型原漿酒中4種高級醇的含量，結果見圖7。

圖7 生產車間高級醇產量

由圖7可知，在仰韶陶融型生產車間添加1.50%的純種麩曲酵母，正丙醇產量比沒有添加純種麩曲酵母的降低了49.1%，正丁醇產量比沒有添加純種麩曲酵母的降低了28.8%，異丁醇產量比沒有添加純種麩曲酵母的降低了11.4%，異戊醇產量比沒有添加純種麩曲酵母的降低了16.9%。在未添加酵母時，生產車間釀造出的酒樣中4種高級醇含量均比實驗室含量低，這可能與生產車間窖池中窖泥的存在有關。在酵母添加量為1.50%時，生產車間釀造出的酒樣中4種高級醇除了正丙醇含量比實驗室含量低，其余3種高級醇含量均高于實驗室酒樣含量，因為車間酒醅的水分、大曲用量、谷殼用量、酒醅pH值、酒醅與糧食配比等對高級醇的產量都有很大影響，而整個操作過程全部是憑借生產經驗來進行，因此每次都會有一定的操作誤差，這對結果帶來一定的影響。

3 結論

通過額外添加酵母菌，實驗室模擬發酵陶融型酒樣，在酵母添加量達到1.50%的比例時，正丙醇生成量最低，產量降低了76.8%，在酵母添加量達到2.0%時，正丁醇生成量最低，產量降低了55.3%，異丁醇在酵母添加量為1.0%時，生成量最低，產量降低了72.2%，異戊醇在酵母添加量為1.50%時，產量最低，為0.517 g/L，比不添加酵母時異戊醇產量降低了47.6%。生產車間在添加1.50%酵母時，正丙醇產量比不添加純種麩曲酵母時降低了49.1%，正丁醇產量比不添加純種麩曲酵母時降低了28.8%，異丁醇產量比不添加純種麩曲酵母時降低了11.4%，異戊醇產量比不添加純種麩曲酵母時降低了16.9%。

近年來，有關通過酵母添加量的方法來降低原漿酒中高級醇含量的研究報道較少。本研究使陶融型原漿酒中高級醇總產量降低了55.68%，比孫金旭[13]在酵母添加量對醬香型白酒中雜油醇影響的研究中總高級醇產量降低了16.03%，比邢曉晰[16]利用纖維素酶在白酒生產中的應用研究總高級醇產量降低了40.86%，比羅惠波[17]通過酶制劑對濃香型白酒發酵過程中高級醇生成的影響研究中總高級醇產量降低了40.87%。本研究成本低，工藝簡單，陶融型原漿白酒中高級醇的生成量降低顯著，研究對生產陶融型白酒的指導意義重大。

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