P ML-RARα和IFN-γ重組載體的構建

胡剛

（廣東省惠東縣人民醫院內六科，廣東 惠東 516300）

聯合化療和誘導分化治療已經顯著改善了急性早幼粒細胞白血病患者的預后，但微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）仍是患者日后復發的根源。利用特異免疫治療，尤其是在疾病處于緩解期，利用白血病疫苗誘導患者產生抗白血病的特異免疫功能，是一種理想的預防疾病復發的方式。我們在前期研究已經發現利用PML-RARα基因片段與IL-2等構建的重組表達載體能夠誘導特異性免疫應答，但其免疫原性欠佳，難以獲得足夠的免疫保護作用［1-3］。本研究將PML-RARα基因與IFN-γ基因同時插入到一個載體中，構建含有PML-RARα及IFN-γ雙基因表達載體，IFN-γ作為免疫佐劑可以增強DNA疫苗的免疫效應。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所使用的質粒和細胞株（pIRES質粒、IFN-γ質粒、NB4細胞株）由暨南大學血液病研究所提供。用于轉化的菌株（DH5α感受態菌株）購自北京天為時代生物公司。LB培養基購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法 p IRES-PML-RARα-IFN-γ真核雙表達質粒構建過程見圖1。

1.2.1 引物設計與合成 結合待擴增基因的自身特點，利用引物設計軟件設計用于擴增PMLRARα和IFN-γ基因的引物，在設計過程中向引物中加入酶切位點，設計的引物標記為P1 P2和P3 P4，設計的引物由上海博亞生物公司合成，引物序列：（1）引物P1 P2：（用于擴增PML-RARα基因）：上游引物 P1：5′-CAAGCTAGCAGCATG GTCTCCAATACAACGA-3'，下 游 引 物 P2：5'-GCGACGCGTTCAGTCCTGACAGACAAAG-3'；（2）引物P3 P4：（用于擴增IFN-γ基因）：上游引物P3：5'-GCTCTAGAGATTTCAACTTCTTTGGCTTA-3'，下 游 引 物 P4：5'-TTGTCGACGCAGGCAGGA CAACCATTACT-3'。2對引物擴增的目的基因片段大小分別為384 bp和553 bp。

圖1 p IRES-PML-RARα-IFN-γ真核雙表達載體構建過程圖

1.2.2 PCR獲取PML-RARα基因 由于NB4細胞株中含有PML-RARα基因，因此我們選取該細胞株用常規方法提取出細胞的總RNA，以RNA作為模板合成cDNA，然后以該cDNA作為模板，以P1和P2作為引物獲取PML-RARα基因。PCR反應體系（總體積20μl），其中包括2μl cDNA和1 U聚合酶，其余試劑的濃度分別為引物0.5μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L。PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，連續循環30次；最后72℃延伸6min。反應在德國BioMetra公司生產的PCR擴增儀上進行，常規電泳并用試劑盒回收經過電泳驗證的PCR產物，PCR產物標記為PCR1。

1.2.3 PCR擴增IFN-γ基因 以商品質粒作為模板，以P3和P4作為引物，通過PCR獲取IFN-γ基因。PCR反應體系（總體積20μl），其中包括2 μl cDNA和1 U聚合酶，其余試劑的濃度分別為引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，MgCl21.5mmol/L。PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性1min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1min，連續循環30次；最后72℃延伸6min。PCR產物標記為PCR2。

1.2.4 pIRES-PML-RARα重組質粒的構建和鑒定 以NheⅠ和MluⅠ作為內切酶，對PCR產物（PCR1）進行酶切，然后與經過同樣切割處理的載體進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌（DH5α感受態菌）。轉化過程如下：取10μl連接產物加入100μl DH5α感受態菌中，冰上孵育30min；置于42℃水浴90 s；加入800μl SOC培養基后于37℃搖床130 r/min 1.5 h；菌液鋪于LB瓊脂培養皿中，37℃溫箱過夜。

1.2.5 p IRES-PML-RARα-IFN-γ重組質粒的構建和鑒定 以SalⅠ和XbaⅠ作為內切酶，對PCR2進行酶切處理后與質粒pIRES-PML-RARα進行連接，連接產物轉化大腸桿菌（DH5α感受態菌）。轉化過程：挑取陽性克隆置于100μl LB培養基中，用載體上的公共引物進行菌落PCR鑒定；篩選出產物大小正確的克隆，取80μl菌液置于10ml LB培養基中于37℃搖床130 r/min過夜培養；常規提取質粒。

1.2.6 DNA序列分析 取1μl構建的質粒DNA作為樣本交由上海博亞生物技術公司進行序列分析。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 利用引物P1 P2和P3 P4分別從相應的模板（NB4細胞的cDNA和IFN-γ質粒）中擴增出大小為384 bp和553 bp的基因片段。電泳結果顯示，兩種PCR產物大小符合預期，見圖2。

圖2 PML-RARα基因和IFN-γ基因PCR產物電泳圖

2.2 菌落平板 被pIRES-PML-RARα-IFN-γ質粒轉化后的DH5α感受態菌，見圖3。

圖3 轉化了p IRES-PML-RARα-IFN-γ的菌落

2.3 菌落PCR 取出單個菌落，溶解于100μl LB培養液中，取1μl溶解液作為模板，以P1P2作為引物，進行PCR，PCR結果見圖4，第5泳道為目的基因PML-RARα片段（384 bp）PCR結果，第1、3泳道為另一PML-RARα片段（245 bp）PCR結果。

M：Marker，1、3、5泳道為陽性結果，2、4、6泳道為陰性結果。其中第5泳道為目的基因PML-RARα片段（384 bp）PCR結果，第1、3泳道為另一PML-RARα片段（245 bp）PCR結果

2.4 重組質粒的構建及鑒定 依照p IRES-PMLRARα-IFN-γ構建過程圖所示的方法分別構建pIRES-PML-RARα和pIRES-PML-RARα-IFN-γ載體。構建的重組載體通過雙酶切（2組內切酶分別為NheⅠ、MluⅠ和XbaⅠ和SalⅠ）證實有大小為384 bp和553 bp的目的片段插入，見圖5。

圖5 p IRES-PML-RARα-IFN-γ重組質粒雙酶切鑒定

2.5 序列分析結果 經過序列分析，插入到pIRES質粒中的兩個目的基因片段與預期完全一致，測序結果證實重組質粒中外源插入片段分別與GenBank中PML-RARα基因和IFN-γ基因序列完全一致，PML-RARα基因測序結果見圖6。

2.6 序列比對結果 比對結果顯示：插入到PIRES質粒多克隆位點A（MCS A）中的PMLRARα基因片段和插入到多克隆位點B（MCSB）中的IFN-γ基因序列，與Genebank中的PMLRARα基因和IFN-γ基因序列完全一致。

圖6 p IRES-PML-RARα-IFN-γ重組質粒中PML-RARα基因片段序列分析結果

3 討論

對于急性早幼粒細胞白血病患者，應用全反式維甲酸誘導分化治療可以使大部分患者得到緩解甚至治愈。而作為靶向治療最為經典的代表藥物甲磺酸伊馬替尼的出現，則讓無數慢性粒細胞白血病患者大大增強了戰勝白血病的信心，但是MRD的存在卻讓臨床醫生和研究人員大為苦惱。所謂MRD是指白血病經過化療或骨髓抑制等治療后，體內仍然殘留少許白血病細胞，這些細胞難以用傳統方法檢測到，但卻是患者日后白血病復發的根源。如何根除MRD已經成為血液科醫生和研究人員所面臨的一個共同難題。

作為抗腫瘤治療的一個重要手段，免疫治療是有可能根除MRD的方法之一。DNA疫苗制備過程簡單，不會引起自身免疫反應，可以誘導針對腫瘤細胞的特異性殺傷性T細胞（CTL），并且不會與宿主DNA整合。在DNA疫苗的研發過程中，首先需要選擇合適的基因片段用于誘導機體產生保護性免疫反應，然后還需要通過各種技術手段增強疫苗的免疫效應。融合基因存在于許多白血病患者體內，它既是致病的根源，也是治療的靶點，因此利用融合基因制備DNA疫苗可用于治療白血病。有研究發現應用BCR-ABL融合基因制備的DNA疫苗，可以在動物體內誘導產生針對含有BCR-ABL融合基因的白血病細胞的CTL［4-5］。而PML-RARα融合基因片段或者由該基因翻譯的多肽在動物實驗中均可誘導產生針對該基因的特異性免疫應答。然而，通過這些方法獲得的免疫效應比較微弱，并不能對機體產生足夠的保護作用，必須采取一定的技術手段以增強DNA疫苗的免疫原性。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，IFN-γ能夠誘導巨噬細胞、T細胞、B細胞等細胞MHCⅡ分子表達，從而提高抗原提呈能力［6-7］，為了增強 p IRES-PML-RARα質粒的免疫原性，我們選擇將IFN-γ插入到該質粒中使PML-RARα基因和IFN-γ基因同時表達于相同的微環境，利用IFN-γ的佐劑作用增強pIRES-PML-RARα質粒的免疫原性。我們的實驗成功構建了PML-RARα-p IRES-IFN-γ質粒，下一步我們將通過體外實驗和動物實驗進一步驗證該質粒的有效性。

參考文獻：

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［2］Li Y，Lin C，Schmidt CA.New insights into antigen specific immunotherapy for chronic myeloid leukemia［J］.Cancer Cell Int，2012，12（1）：52.

［3］胡剛，周羽竝，岑東芝，等.PML-RARα245與hGM-CSF雙基因DNA疫苗的構建與表達［J］.江蘇醫藥，2013，39（8）：878-881.

［4］Sun JY，Krouse RS，Forman SJ，etal.Immunogenicity of a p210（BCR-ABL） fusion domain candidate DNA vaccine targeted to dendritic cells by a recombinant adeno-associated virus vector in vitro［J］.Cancer Res，2002，62（11）：3175-3183.

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