USP39在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

湯潔，趙瑩瑩，魏威

（解放軍第202醫院生殖醫學中心，遼寧 沈陽 110001）

宮頸癌是女性發病率最高的腫瘤之一，其致死率高居婦科腫瘤第四位［1］。盡管宮頸癌的篩查、診斷和治療取得了巨大的進步，但進展期的宮頸癌患者預后仍不容樂觀［2-4］。因此，鑒定準確度更高的診斷和治療靶點顯得尤為迫切。泛素-蛋白酶體途徑是生物體內蛋白質降解的主要途徑之一［5-6］。泛素化特異性蛋白酶39（ubiquitinspecific protease，USP39）是高度保守性蛋白，是去泛素化家族成員之一［7］。前期研究表明，USP39在多種腫瘤組織中表達異常升高，并可促進腫瘤的發生及進展［8-9］。USP39在宮頸癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性，鮮見相關報道。本研究擬通過實時定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）技術檢測USP39在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達情況，并分析其與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本采集 收集2007年6月至2011年12月于解放軍第202醫院婦產科接受宮頸癌根治術患者的腫瘤組織及癌旁組織標本94例，經術后病理組織學檢測確診。組織標本收取后置于液氮中冷凍用于后續實驗。入組患者在術后3個月開始隨訪，隨訪截止時間點為患者因腫瘤復發死亡或至2016年12月31日本研究截止之日。截至研究截止日共獲得完整隨訪資料90例，隨訪率為95.74%，中位隨訪時間為 46.32 個月。所有入選的宮頸癌患者術前均未進行放療、化療等治療。本研究經解放軍第202醫院倫理委員會審核并批準，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄 RNA提取采用Trizol法（Trizol購買于美國Sigma公司）。將液氮冷凍過的組織研磨成粉末狀，加入1ml Trizol繼續研磨至裂解液呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min，將上清液轉移至另一離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15min。吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1ml，12 000 r/min 4℃離心5min。所得沉淀加入20μl去離子水，即為所需RNA。反轉錄采用10μl體系，RNA定量后，取 1μl RNA，加入 2μl日本 TaKaRa公司 5×PrimeScript RTmaster，7μl去離子水。輕柔混勻后，進行反轉錄反應。反應條件為：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃儲存。

1.2.2 qRT-PCR 采用 日 本 TaKaRa 公司 SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進行qRT-PCR，首先配置PCR反應液，PCR反應采用25μl體系，組分如下：12.5 μl SYBR premix Ex TaqⅡ，1 μl USP39或β-actin正義鏈引物，1μl USP39或β-actin反義鏈引物，2 μl反轉錄產物，8.5 μl去離子水。PCR反應條件為：預變性95℃ 30 s；擴增95℃ 15 s，60℃30 s，共40個循環。反應結束后樣品保存于4℃。USP39引物序列：正向引物5′-CCAGCGAT GGCAACTAC-3′，反向引物 5′-ACCACAACGGAA ACACG-3′；β-actin引物序列：正向引物5′-CGTC TTCCCCTCCATCGT-3′，反向引物 5′-GAAGGTGT GGTGCCAGATTT-3′。采用 2-ΔΔCt公式計算 USP39相對表達量，ΔΔCt=（CtUSP39-Ctβ-actin）待測樣本-（CtUSP39-Ctβ-actin）校準樣本。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中USP39的表達差異，采用Spearman秩相關分析USP39與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性，繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-rank檢驗比較USP39高表達組和低表達組5年總體生存率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 USP39 mRNA在宮頸癌及癌旁組織中的表達 qRT-PCR結果顯示，USP39mRNA在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達水平分別為7.237±1.452 和 1.514±0.275，差 異 有 統 計 學 意 義（t=3.328，P=0.031）。

2.2 USP39的表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 根據宮頸癌組織中USP39的qRTPCR結果，USP39 mRNA表達水平的均數為4.283，本研究將 USP39 相對表達水平高于 4.283的患者作為USP39高表達組，將USP39相對表達水平低于4.283的患者作為USP39低表達組，其中，USP39高表達組患者為57例，USP39低表達組為37例。利用Spearman秩相關分析USP39表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性。結果顯示：USP39的表達水平與宮頸癌患者FIGO分期和淋巴結轉移情況呈正相關（r分別為0.625和0.732，P＜0.05），而與其他臨床病理特征無顯著相關性，見表1。

表1 USP39表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性

2.3 USP39的表達與宮頸癌患者術后5年總體生存率的關系 Kaplan-Meier生存曲線顯示，USP39高表達組的宮頸癌患者術后5年總體生存率低于USP39低表達組（Log-rank檢驗=6.102，P=0.014），見圖1。

圖1 USP39表達水平與宮頸癌患者術后5年總體存活率之間的關系

3 討論

本研究通過qRT-PCR技術檢測宮頸癌組織及癌旁組織中USP39 mRNA的表達情況，發現USP39mRNA在宮頸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義。通過進一步的統計分析，發現宮頸癌組織中USP39的表達水平與宮頸癌患者的FIGO分期及淋巴結轉移情況密切相關。本研究同時發現宮頸癌組織中USP39高表達的患者術后5年總體生存率明顯低于USP39低表達患者，差異亦有統計學意義。

USP39分子量大小為65 kDa，是泛素特異性蛋白酶體家族成員，其含有一個去泛素化酶域［10］。然而USP39缺少蛋白酶活性的三個關鍵殘基，因此，盡管其有去泛素化酶域，USP39仍缺乏去泛素化酶活性［7］。USP39參與調控斑馬魚垂體細胞生長并維持垂體的動態平衡［11］。沉默USP39的表達可使Aurora B激酶水平下降，從而影響紡錘體檢測點和細胞分裂［12］。有研究顯示USP39在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織及正常乳腺組織，沉默USP39可使乳腺癌細胞周期阻滯于G0/G1期及促進細胞凋亡［13］。USP39還可通過去除小泛素樣修飾物而促進前列腺癌細胞的增殖［14］。以上研究提示，USP39通過參與腫瘤細胞凋亡和周期的調控，在腫瘤發生發展中發揮癌基因的作用，通過促進腫瘤細胞增殖，從而促進腫瘤的進展。本研究結果亦提示USP39在宮頸癌中可能扮演癌基因的角色，USP39高表達患者的5年總體生存率顯著低于低表達患者。

綜上所述，本研究通過檢測宮頸癌組織及癌旁組織中USP39 mRNA的表達水平，初步證實USP39在宮頸癌組織中表達異常升高，并與宮頸癌患者FIGO分期、淋巴結轉移情況及患者術后5年總體生存率密切相關。本研究結果提示USP39可作為宮頸癌患者生存周期的潛在分子標志物。

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