SAHA抑制乳腺癌ER受體陽性細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞侵襲的形態(tài)學(xué)觀察

劉春陽，周偉強(qiáng)

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級(jí)，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

有研究發(fā)現(xiàn)，70%～80%的乳腺癌患者的雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)為陽性［1-3］。ER與多種生長因子及激酶相互作用促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，提示在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，ER對于乳腺癌的進(jìn)展扮演著重要角色。因此設(shè)法通過促進(jìn)ER的降解而降低其表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，有可能成為乳腺癌耐藥患者新的治療策略［4］。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）是一類與組蛋白乙酰化酶有拮抗作用的化合物［5］。HDACi通過增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙酰化程度，而誘導(dǎo)諸如p53、p21CIP1等抑癌基因的表達(dá)水平，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。作為HDACi的一種，SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移具有抑制作用，但其作用機(jī)制還不是十分的清楚［6-7］。因此本文將SAHA作用于乳腺癌ER受體陽性細(xì)胞系MCF-7，通過形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察SAHA對MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室凍存；RPIM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Thermo公司；SAHA及人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞染色液購自美國Cell Biolabs公司；Tanswell小室購自美國Corning公司；其他的化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100μg/m l的鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)用于下面各個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將5×105/ml的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板的各個(gè)孔中。加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞同步化。將10μmol/L SAHA與含10%血清的正常培養(yǎng)液加入細(xì)胞中共同培養(yǎng)24 h。另取0.625 nmol/L Leptin作為細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑與SAHA共同作用。將各組細(xì)胞加入10 μmol/L BrdU孵育60min后，加入包被Fluorescein的抗BrdU抗體（Millipore）室溫孵育1 h后，應(yīng)用Leica DMI6000 B熒光顯微鏡觀察，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將3×105/ml的MCF-7細(xì)胞接種于24孔板的各孔中。當(dāng)細(xì)胞鋪滿至90%時(shí)，用無菌200μl移液槍頭在24孔板各孔中心位置劃一條垂直線。PBS洗3次去除劃下的細(xì)胞后加入無血清RPIM-1640培養(yǎng)基同步化處理24 h。加入10μmol/L SAHA與MCF-7細(xì)胞共同孵育0、4、12、24、32、48、72 h后分別取樣，加入400 μl細(xì)胞染液。待染色15min后應(yīng)用Leica DMI6000 B顯微鏡觀察，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 取RPIM-1640稀釋的100 μl Matrigel膠分別加入24孔Transwell各室中，37℃孵育4 h。將6×106/ml的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿率＞50%時(shí)，加入10μmol/L SAHA共同孵育24 h后，以5×105/m l比例懸浮細(xì)胞并移入Transwell上室200μl，Transwell下室加入含5μg/ml Fibronectin的600μl細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h。將附有細(xì)胞的Transwell膜剪下，Calcein A M染色10 min，應(yīng)用Leica DMI6000 B顯微鏡觀察，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SAHA干擾了MCF-7細(xì)胞DNA復(fù)制 從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞熒光點(diǎn)散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，SAHA處理后的細(xì)胞大多呈梭形，變細(xì)長，細(xì)胞質(zhì)呈放射狀向外突出，并發(fā)生胞質(zhì)外滲現(xiàn)象，熒光點(diǎn)散在分布于細(xì)胞內(nèi)，核周分布較少。而經(jīng)細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑Leptin處理后熒光明顯增強(qiáng)，且核周顯現(xiàn)大量整合BrdU熒光點(diǎn)的信號(hào)。

圖1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測SAHA對乳腺癌MCF-7細(xì)胞DNA復(fù)制能力的影響（Leica DMI6000 B顯微鏡）

2.2 SAHA顯著抑制了乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移力 從圖2中可以看出，SAHA作用MCF-7細(xì)胞4 h時(shí)對細(xì)胞無明顯作用。當(dāng)作用12 h時(shí)可發(fā)現(xiàn)劃痕邊緣細(xì)胞開始變少，鮮見向劃痕中心游走的細(xì)胞。當(dāng)SAHA作用24 h時(shí)，劃痕邊緣細(xì)胞明顯減少、脫落，開始向周圍散落。當(dāng)SAHA作用32 h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞呈星狀、針形。當(dāng)SAHA作用48 h后，劃痕周圍的細(xì)胞已大部死亡。而Lepitn處理的MCF-7細(xì)胞形態(tài)完好，32 h后就大部分填滿劃痕缺口。

2.3 SAHA抑制了乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲力 從圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，SAHA處理后的乳腺癌細(xì)胞穿透Transwell膜的數(shù)量明顯少于對照組和Leptin處理組，并且穿過膜的細(xì)胞生長狀態(tài)不好，大多已聚團(tuán)死亡。而Leptin處理組的細(xì)胞穿透Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞鋪展良好，顯示較好的生長狀態(tài)。

3 討論

組蛋白是真核生物核染色體的重要組成成分。核心組蛋白可以通過乙酰化和去乙酰化修飾調(diào)控DNA的表達(dá)，因此組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾是生物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控系統(tǒng)。SAHA通過促使染色體的解聚，激活抑癌基因的轉(zhuǎn)錄而影響腫瘤細(xì)胞的增殖過程［8-10］。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SAHA對乳腺癌MCF-7細(xì)胞游走性的影響（Leica DMI6000 B顯微鏡，20×）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SAHA顯著限制MCF-7游走性。經(jīng)10μmol/L SAHA處理MCF-7細(xì)胞后劃痕邊緣細(xì)胞明顯減少、脫落，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞呈星狀、針形。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可以看出，SAHA處理后的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈放射狀向外突出，并發(fā)生胞質(zhì)外滲現(xiàn)象，熒光點(diǎn)散在分布于細(xì)胞內(nèi)，核周分布較少。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，SAHA處理后的細(xì)胞穿透Transwell膜的數(shù)量明顯少于對照組和Leptin處理組，并且穿過膜的細(xì)胞生長狀態(tài)不好，大多已聚團(tuán)死亡。這些形態(tài)學(xué)的觀察都證實(shí)SAHA確實(shí)限制了MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。

本文從形態(tài)學(xué)角度觀察了SAHA對乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲力的影響，具有重要的科學(xué)和臨床應(yīng)用價(jià)值，但其具體的作用途徑有待進(jìn)一步研究。

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