黑木耳中多糖和類黃酮的隔氧提取及其協同抗氧化作用

王 鵬,郭 麗,姜 喆,郭艷莉,馬 雪,李 楊

(綏化學院食品與制藥工程學院,黑龍江綏化 152061)

黑木耳(Auriculariaauricular)又名黑菜、光木耳、云耳等,屬真菌類擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。黑木耳作為藥食同源真菌,營養價值和藥用價值高,特別是黑木耳中多糖和類黃酮化合物具有抗氧化[1-4]、降血脂降膽固醇[1,5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7-8]等多種功效,逐漸得到人們的廣泛關注。

有關黑木耳抗氧化物質的提取方法,主要集中在熱水浸提[9-10]、乙醇溶液浸提[11]、回流提取[8]、超聲波和微波輔助提取[9,12-13]開展研究,獲得的黑木耳抗氧化多糖和類黃酮具有較好的清除自由基的能力,可抑制脂質過氧化,體外抗氧化效果顯著。但在提取過程中黑木耳多糖和類黃酮的穩定性受氧氣等因素影響而產生損失,隔氧提取可有效防止物質氧化,使生物活性物質發揮卓越功效,但目前有關隔氧提取黑木耳抗氧化成分的研究還鮮有報道。

黑木耳多糖和類黃酮因其優越的抗氧化功效成為天然抗氧化劑的良好來源,Peng等[14]建立小鼠皮膚光老化模型,體內實驗發現黑木耳多糖可提高小鼠SOD和GSH-Px,延緩并抑制脂褐素和MDA的產生。張威[8]利用80%乙醇回流提取木耳黃酮和多酚,二者含量與抗氧化活性和抗腫瘤活性呈正相關。Fan等人[15]研究發現,添加9%木耳多糖粉的面包感官質量不變,木耳多糖粉在面包中具有較好的抗氧化效果。多種抗氧化活性物種聯合使用時,其抗氧化活性往往較同濃度同劑量下的單一物質抗氧化活性強。因此,研究黑木耳抗氧化物質多糖和類黃酮之間的協同增效作用,尋找高效快速的復合方法對開發黑木耳新產品,提高其抗氧化效率具有重要意義。

本實驗研究隔氧條件下超聲波輔助提取黑木耳多糖、黑木耳類黃酮,將黑木耳多糖和類黃酮組合,探討二者之間協同抗氧化作用,以期為開發綠色、高效的天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 黑龍江省綏化市;蘆丁標準品、葡萄糖標準品、DPPH 美國sigma公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、六氰合鐵酸鉀、苯酚、鄰二氮菲、鄰苯三酚、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷等試劑 均為國產分析純。

KQ-600D 型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海析譜儀器有限公司;80-2B型離心機 湖南星科科學儀器有限公司;FW135型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 上海科靂儀器設備有限公司。

湖北襄陽大頭菜是湖北襄陽的農家品種[1]，更是我國四大名腌菜之一。襄陽大頭菜歷史悠久，為諸葛亮隱居襄陽隆中時所創，在民間享有“諸葛菜”、“孔明菜”之美稱[2]。但是襄陽大頭菜的生產總體處于粗放式加工狀態，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現，大頭菜的脆度明顯降低且產生刺激性氣味，最終導致產品品質下降直至失去經濟價值。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取 用萬能粉碎機粉碎一定量的干燥黑木耳,過60目篩,稱取5.0 g黑木耳粉,加入雙蒸水(提取劑提前在0.1 MPa脫氣10 min),采用超聲波儀提取黑木耳多糖,提取條件:固液比1∶55 (w/v),超聲波功率200 W,提取溫度50 ℃,提取時間40 min,選擇兩種提取環境,分別為隔氧提取和有氧提取。隔氧提取采用減壓提取,將樣品和提取溶劑按比例加入圓底燒瓶進行抽真空處理,真空度為0.09 MPa。

1.2.2 黑木耳類黃酮的提取 取上述黑木耳干粉5.0 g,加入60%乙醇為提取劑(提取劑提前在0.1 MPa脫氣10 min),浸泡1 h,采用超聲波儀提取黑木耳黃酮。提取條件:固液比1∶40 (w/v),超聲波功率400W,提取溫度30 ℃,提取時間30 min,超聲波提取后于8000 r/min離心10 min,取上清液,沉淀重復提取一次,選擇兩種提取環境,分別為隔氧提取和有氧提取。隔氧提取采用減壓提取,將樣品和提取溶劑按比例加入圓底燒瓶進行抽真空處理,真空度為0.09 MPa。

1.2.3 黑木耳多糖、類黃酮含量及抗氧化活性實驗 測定隔氧提取和有氧提取下黑木耳多糖和黑木耳類黃酮的含量。以提取劑雙蒸水和60%乙醇為陰性對照,以維生素C為陽性對照,分別測定兩種條件下黑木耳多糖和黑木耳類黃酮對抗氧化指標還原能力,DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力的影響。

1.2.4 黑木耳多糖和類黃酮復配實驗及協同抗氧化研究

1.2.4.1 黑木耳多糖和類黃酮復配比例的確定 經上述1.2.3研究,確定隔氧提取條件為最佳提取條件,以此條件下提取的黑木耳多糖和黑木耳類黃酮進行復配實驗,以黑木耳多糖、黑木耳類黃酮、維生素 C和維生素E為對照,多糖:類黃酮(v/v)復配比例為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1。分別在反應0 min和30 min進行DPPH自由基清除能力測定,在反應45 min時進行羥自由基清除能力測定,分析不同復配條件下溶液清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。

1.2.4.2 黑木耳多糖和類黃酮復配抗氧化實驗 a.不同濃度復配液的清除自由基能力:確定多糖和類黃酮最佳復配比例后,研究不同濃度復配液的清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。取稀釋后的復配液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mL,定容至2 mL,分別在反應0 min和30 min進行DPPH自由基清除能力測定。取復配液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,定容至1 mL,在反應45 min時進行羥自由基清除能力測定。

b.復配液降溫過程清除自由基能力:研究復配液在降溫過程中清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。溫度分別為60、50、40、30 ℃,在反應45 min時進行羥自由基清除能力測定。

c.復配液在不同反應時間清除自由基能力:研究復配液在不同反應時間清除DPPH自由基能力和羥自由基能力。清除DPPH自由基能力研究,反應時間分別為0、10、20、30、40、50、60 min。清除羥自由基能力研究反應時間分別為30、45、60、75、90、120 min。

1.2.5.1 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法進行多糖含量的測定[16],按下式計算黑木耳多糖提取率。

計算公式為:

式中:X為多糖提取率,%。V1為樣品定容體積,mL;V2為測定時所移取樣品測定液的體積,mL;m1為經稀釋后測定的多糖含量,mg;m2為黑木耳原料干重,g;N為稀釋倍數。

1.2.5.2 類黃酮含量的測定 參考Chun等[17]的方法,略做改動。精密吸取濃度為12.8 mg/100 mL的蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于10 mL的容量瓶中,用60%乙醇溶液補充至5 mL,分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min;再分別加入10%的Al(NO3)溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL,用水稀釋到刻度,放置20 min,在510 nm處測定吸光度,并繪制標準曲線。所得標準曲線方程為:y=5.179x+0.120(R2=0.997)。取一定稀釋倍數的黑木耳類黃酮樣液按標準曲線制作方法測定吸光度值,利用標準曲線計算樣品中類黃酮含量。

類黃酮含量計算公式為:

式中:V1為樣品定容體積,mL;V2為比色測定時所移取樣品測定液的體積,mL;m1為從標準曲線上查得樣品測定液中類黃酮含量,mg;m2為樣品質量,g。

1.2.5.3 還原能力的測定 參考Lee等[18]的方法,略做改動。取1 mL樣液(空白用1 mL蒸餾水代替,其他試劑依次同下)中,加入2.5 mL質量分數為1%的六氰合鐵酸鉀(K3Fe(CN)6)和2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS pH6.6,0.2 mol/L),混勻后在50 ℃保溫20 min,然后加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸,混合后以3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數為0.1%的Fecl3,混勻后在700 nm波長下比色,記錄吸光度值。以25～200 μg/mL VC為標準溶液做標準曲線,以mg VC/mL表示鐵還原能力。

1.2.5.4 DPPH自由基清除能力的測定 參照Yamaguchi等[19]的方法,略做改動。精確配制1×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液,于0～4 ℃避光保存,備用。分別取待測溶液2 mL與DPPH溶液2 mL均勻混合,在黑暗中放置一定時間,于517 nm波長處分別在30 min測定光密度值,空白組以無水乙醇取代DPPH,對照以無水乙醇取代樣品。清除率的計算方法如下:

式中：I表示DPPH自由基清除率,Ai為樣品組吸光度,Aj為空白組吸光度,Ac為對照組吸光度。

1.2.5.5 羥自由基清除能力的測定 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法進行測定[20]。

1.2.5.6 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[21]。

1.3 數據處理

使用SPSS 19.0統計軟件進行分析,采用ANOVA進行鄧肯氏多重差異分析,采用多元線性回歸分析方法進行相關性分析。p<0.05為具有統計學意義上的差異。

2 結果與分析

2.1 提取方式對黑木耳多糖和類黃酮提取率及抗氧化活性的影響

黑木耳多糖和類黃酮在隔氧條件下的提取率及抗氧化活性均高于有氧條件(見表1)。在隔氧條件下,多糖的提取率為3.85%,黑木耳類黃酮的提取率為4.2 mg/100 g;顯著高于有氧方式獲得的多糖和類黃酮提取率(p<0.05)。密閉隔氧提取的黑木耳類黃酮和多糖清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基能力的能力以及還原能力均高于有氧提取類黃酮和多糖(p<0.05)。

表1 隔氧和有氧提取對黑木耳多糖、類黃酮提取率及抗氧化活性對比(n=3)Table 1 Comparison of the content and antioxidant activity of polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricula by aerobic extraction and oxygen-resistant extraction(n=3)

由此可見,隔氧方式提取黑木耳中多糖和類黃酮,在氧含量較低的條件下,避免了二者的氧化降解,使其含量保持較高水平,進而抗氧化活性效果更為突出[22]。

2.2 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮協同抗氧化研究

為了篩選出黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配液協同清除自由基效果,實驗選擇一種以氮為中心的自由基DPPH自由基,一種活性氧自由基羥自由基,用兩種自由基清除效果來綜合評價黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配液協同抗氧化作用。

2.2.1 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配比例對清除DPPH自由基能力的影響 由圖1可見,初始0 min,不同配比黑木耳多糖(濃度為3 mg/mL)和黑木耳類黃酮(濃度為3 mg/mL)復配液之間對DPPH自由基清除能力差異不顯著(p>0.05)。30 min時,隨著多糖體積的增加,類黃酮體積的減少,復配液對DPPH自由基清除能力依次分別增加了30.3%、41.6%、44.5%、47.5%和54.3%,可見隨著多糖含量的增加,復配液清除DPPH自由基能力逐漸增強。復配液配比多糖:類黃酮為9∶1和7∶3時,DPPH自由基清除率較大,分別為100%和95%,二者之間差異顯著(p<0.05)。

圖1 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配后對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radicals scavenging ability of complex with polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricular注:不同小寫字母表示反應初期0 min不同復配物清除DPPH自由基能力差異顯著(p<0.05);不同大寫字母表示反應30 min不同復配物清除DPPH自由基能力差異顯著(p<0.05)。

由圖2可見,不同配比復配液之間對羥自由基清除能力差異顯著(p<0.05),當黑木耳多糖∶黑木耳類黃酮=7∶3時,羥自由基清除率最大,為62%。復配液中多糖碳氫鏈上的氫原子與羥自由基結合成水,而碳原子上剩下的單電子可繼續氧化形成過氧自由基,進一步分解,阻止活性氧等新自由基形成,阻斷連鎖自由基擴增途徑,從而達到抗氧化效果[23]。綜合復配液對DPPH自由基、羥自由基清除能力的影響,確定黑木耳多糖∶黑木耳類黃酮=7∶3為最佳配比。

圖2 黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配后對羥自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radicals scavenging ability of complex with polysaccharides and flavonoids from Auricularia auricular注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 黑木耳多糖和類黃酮復配抗氧化實驗

2.2.2.1 不同濃度復配液的抗氧化能力 由圖3、圖4可見,隨著復配液濃度的增加,復配液對DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力逐漸增加。復配液對DPPH自由基清除能力在0 min和30 min時差異顯著(p<0.05),反應30 min復配液濃度為0.72×10-3mg/mL時,清除率最高為88.65%。復配液濃度為0.432×10-3mg/mL以后,對DPPH自由基清除率維持穩定,差異不顯著(p>0.05)。

圖3 復配液濃度對DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of complex concentration on DPPH radical scavenging ability

由圖4可見,當復配液濃度為3.6×10-3mg/mL時,對羥自由基的清除率達55.6%,隨著復配液濃度的增大,羥自由基的清除能力逐漸增強,復配液濃度在三個范圍區間(1.2～2.4×10-3mg/mL,3.6～4.8×10-3mg/mL,6.0×10-3mg/mL)差異顯著(p<0.05)。

圖4 復配液濃度對羥自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of complex concentration on hydroxyl radical scavenging ability

2.2.2.2 降溫過程中復配液抗氧化能力的變化 圖5為降溫過程復配液的DPPH自由基清除能力變化曲線。60 ℃條件下反應20 min時,復配液對DPPH自由基清除能力最強,之后隨時間延長趨于穩定。溫度下降至40 ℃和50 ℃反應40 min后,復配液的DPPH自由基清除能力達到最高,分別為78.9%、80.6%。溫度下降至30 ℃,復配液對DPPH自由基清除率最低,與其他溫度相比差異顯著(p<0.05)。

圖5 不同溫度下復配液清除DPPH自由基的能力Fig.5 DPPH radical scavenging ability of complex at different temperature

由圖6可見,隨著反應溫度的降低,復配液對羥自由基清除能力呈下降趨勢,各溫度之間羥自由基清除率差異顯著(p<0.05),在60 ℃時,羥自由基清除率為91.6%,30 ℃時清除率為21.4%。

圖6 不同溫度下復配液清除羥自由基的能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging ability of complex at different temperature

2.2.2.3 不同反應時間對復配液抗氧化能力的影響 由圖7可見,復配液對DPPH自由基清除能力隨反應時間的增加而增強,在10～60 min內DPPH自由基清除率變化幅度較小,但與初始0 min相比DPPH自由基清除率差異顯著(p<0.05)。復配液濃度與DPPH自由基的清除能力呈顯著正相關(p<0.05)。在反應60 min時,0.02×10-3mg/mL、0.1×10-3mg/mL、0.3×10-3mg/mL濃度的復配液對DPPH自由基的清除率達到最大,分別為53.9%、71.6%、86.5%。

圖7 不同反應時間下復配液清除DPPH自由基能力Fig.7 DPPH radical scavenging ability of complex in different reaction time

由圖8可見,隨著反應時間的延長,復配液對羥自由基的清除能力呈先上升后下降的趨勢。當反應時間為75 min時,清除率上升至最高,為98.9%;在反應90 min和120 min時,羥自由基的清除率維持穩定,差異不顯著(p>0.05),與其他時間處理相比差異顯著(p<0.05)。

圖8 不同反應時間下復配液清除羥自由基能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging ability of complex in different reaction time

3 結論

與有氧提取相比,隔氧提取獲得的黑木耳多糖、黑木耳類黃酮含量較高,分別為3.85%、4.2 mg/100 g;同時清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基能力,還原能力較強。

黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配比例為7∶3時,清除DPPH自由基能力為95%,清除羥自由基能力為62%。隨著黑木耳多糖和黑木耳類黃酮復配液濃度增加,對DPPH自由基和羥自由基清除能力增大;降溫過程中,40 ℃和50 ℃反應40 min后,對DPPH自由基和羥自由基清除能力達到最大,二者差異不顯著(p>0.05)。0.3×10-3mg/mL濃度的復配液對DPPH自由基的清除率在60 min時達到最大,為86.5%,75 min時,復配液對羥自由基清除率上升至最高,為98.9%。

綜上,經過隔氧條件提取得到的黑木耳多糖和類黃酮,其提取率及抗氧化活性均高于有氧條件提取物;黑木耳多糖和類黃酮復配品可提高對DPPH自由基和羥自由基清除效率,具有協同抗氧化作用。

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