酶解牡丹籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化

閻 震,郭 溆,張金寶,王 青,程安瑋,賀圣文,孫金月,4,*

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,山東濰坊 261053;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100;3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,山東濰坊 261053;4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東濟(jì)南 250100)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia),為多年生落葉小灌木。牡丹籽含油量豐富,籽油中不飽和脂肪酸總量為80%～92%,其中亞麻酸含量為 32%～67%,亞油酸含量為 19%～35%[1-2]。α-亞麻酸作為人體的必需脂肪酸,具有降膽固醇、降血脂等多種保健功能。2011年3月國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)鳳丹和紫斑牡丹籽油為新資源食品,我國油用牡丹種植面積急劇擴(kuò)大,牡丹籽產(chǎn)量逐年提高,油脂提取后產(chǎn)生大量的牡丹籽餅粕。目前這些餅粕主要作為飼料原料或食用菌培養(yǎng)基基料,綜合開發(fā)利用水平較低,對(duì)其研究主要集中在牡丹籽餅粕蛋白的提取工藝優(yōu)化和性質(zhì)評(píng)價(jià)[3-6]。牡丹籽餅粕蛋白含量約25%,由于牡丹籽蛋白組成復(fù)雜,水溶性差,極大地限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1960年Marcuse首次報(bào)道了多肽具有抗氧化活性[7],此后對(duì)食源性抗氧化肽的活性研究引起廣泛關(guān)注,并發(fā)現(xiàn)許多來自食物蛋白的寡肽或多肽具有抗氧化活性[8-11]。抗氧化肽是介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的肽類,由5～16個(gè)氨基酸殘基組成[12],與其它生物分子相比,具有極強(qiáng)的生物活性和多樣性,抗氧化性更為顯著,安全性高[13]。但目前用牡丹籽粕蛋白研發(fā)活性肽的研究還鮮見報(bào)道,個(gè)別有關(guān)牡丹籽蛋白酶解的工藝優(yōu)化多以提高水解度為目標(biāo)[14-15]。由于水解度與抗氧化能力之間并不是單純的線性關(guān)系[16],根據(jù)蛋白水解度制備的抗氧化肽的活性還不是很高。

該研究將利用制備的牡丹籽粕蛋白為原料,探究應(yīng)用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化制備抗氧化活性肽的最佳酶解條件,獲得利用牡丹籽粕蛋白制備具有較強(qiáng)抗氧化活性多肽的最佳工藝,為牡丹籽粕的精深加工開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽 山東菏澤堯舜牡丹生物技術(shù)有限公司;堿性蛋白酶(2.4AU-A/g)、中性蛋白酶(0.8AU-A/g)、復(fù)合蛋白酶(1.5AU-A/g)、風(fēng)味蛋白酶(500LAPU/g) 諾維信公司;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鹽酸等均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電熱恒溫水浴鍋DK-S24型 上海精宏公司;臺(tái)式酸度計(jì)FE20K型 美國梅特勒-托利多公司;電子天平AR423CN型 美國奧豪斯公司;紫外分光光度計(jì)UV-1800型 日本島津公司;高效冷凍離心機(jī)Allegra 25R型 美國 Beckman公司;超低溫冰箱907型 美國賽默飛世爾公司;真空冷凍干燥機(jī)Lab-1A-50E型 北京博醫(yī)康公司;離心機(jī)LXJ-ⅡB 上海安亭科學(xué)儀器廠;全自動(dòng)氨基酸分析儀L-8900 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽粕蛋白的制備 稱取80 g牡丹籽粕加入2000 mL去離子水,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH到11.0,180 W超聲2.5 h,使蛋白充分溶解,5000 r/min離心10 min,去沉淀留上清,收集上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH至3.80,5000 r/min離心10 min,去上清留沉淀,沉淀置于-60 ℃真空冷凍干燥機(jī)中凍干,-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白酶的篩選 稱取制備的牡丹籽粕蛋白5份,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、溶于去離子水,然后分別加入5種酶,加酶量6.25%,在各自最適溫度和pH條件下酶解8 h,5種酶情況詳見表1。酶解8 h后,將酶解液置于沸水中10 min滅酶活,10000 r/mmin離心10 min,在酶解過程的不同時(shí)刻記錄為維持pH恒定所加入的NaOH的量計(jì)算水解度,取上清液凍干,配制成相同濃度的多肽溶液測(cè)定DPPH自由基清除能力。

表1 5種蛋白酶水解牡丹籽粕蛋白的最適酶解條件Table 1 Optimal reaction conditions of five enzymesused for hydrolysis of peony seed meal protein

1.2.3 牡丹籽粕蛋白的酶解 稱取制備的牡丹籽粕蛋白溶于去離子水,置于80 ℃水浴中預(yù)熱20 min,然后用0.5 mol/L NaOH溶液將混合液pH快速調(diào)至8.0;加入堿性蛋白酶的量為6.25%,緩慢攪拌混勻后,于50 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解,通過滴加0.5 mol/L NaOH溶液使混合液pH保持不變,并記錄一定時(shí)間間隔的堿液消耗量,來計(jì)算牡丹籽粕蛋白的水解度。2 h后將酶解液置于沸水中10 min滅酶活,冰浴迅速冷卻,10000 r/min離心10 min,取上清液冷凍干燥備用。

1.2.4 多肽制備的單因素實(shí)驗(yàn) 在選用最佳蛋白酶堿性蛋白酶的基礎(chǔ)上,以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量([E]/[S])、酶解溫度、酶解pH為自變量,以DPPH自由基清除率和水解度為響應(yīng)值,研究各單因素對(duì)制備多肽的抗氧化活性的影響。在酶解溫度50 ℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、加酶量6.25%、pH8.0、酶解時(shí)間2 h的條件下酶解牡丹籽粕蛋白,設(shè)置各因素的水平分別為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、0.75%、1%、2%、3%、4%;水解時(shí)間1、1.5、2、2.5、3、3.5 h;加酶量2.50%、3.75%、5%、6.25%、7.50%、8.75%;酶解溫度45、50、55、60、65 ℃;酶解pH6.0、7.0、8.0,9.0、10.0。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素基礎(chǔ)上篩選出影響較大的四個(gè)因子進(jìn)行 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。固定pH=8.0,選擇時(shí)間(A)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、溫度(C)、加酶量(D)為自變量,以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。確定利用酶解牡丹籽粕蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的自變量因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的自變量因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Independent variables and theirlevels used in response surface design

1.2.6 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.6.1 牡丹籽粕蛋白酶解物水解度的測(cè)定 根據(jù)pH-state 法[17]計(jì)算水解度(DH)。pH-state法是根據(jù)水解過程中釋放質(zhì)子的量進(jìn)行水解度的測(cè)定。在蛋白質(zhì)水解過程中記錄不同時(shí)刻為維持反應(yīng)體系pH恒定而消耗的堿量,根據(jù)消耗的堿量按下式計(jì)算出蛋白質(zhì)的水解度。

式中,C:NaOH溶液濃度(mol/L);V:NaOH溶液消耗體積(mL);m:樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量(g);h:每克原料牡丹籽粕蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)(h=7.84 mmol/g);T:實(shí)驗(yàn)溫度(K)。

1.2.6.2 牡丹籽粕蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定 將待測(cè)樣品配制成濃度為133.3 mg/L的溶液,取2 mL溶液加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液,混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)i。空白組加入2 mL樣品液和2 mL去離子水,吸光度值為Aj。對(duì)照組加入2 mL DPPH溶液和2 mL去離子水,用4 mL無水乙醇調(diào)零,測(cè)定吸光度值為A0[18-20]。計(jì)算公式:

1.2.7 多肽中氨基酸組成分析 使用氨基酸全自動(dòng)分析儀,根據(jù)GB 5009.124-2016對(duì)制備得到的牡丹多肽粉進(jìn)行17種水解氨基酸組成分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。p<0. 05表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01說明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解蛋白酶的篩選

5種蛋白酶水解牡丹籽粕蛋白的水解度隨酶解時(shí)間的變化曲線如圖1A所示。水解反應(yīng)都符合典型的酶學(xué)進(jìn)程曲線,但每種酶又表現(xiàn)出各自不同的反應(yīng)特性。牡丹籽粕蛋白的水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大,酶解反應(yīng)的最50 min內(nèi),水解度增加較快,100 min后變緩。水解曲線結(jié)果表明,在前50 min水解速度從高到低依次為:復(fù)合蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>木瓜蛋白酶;50 min后復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶的水解度增加趨勢(shì)仍然較為明顯,其余三種酶的水解度則上升緩慢,其中木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的水解速度最為緩慢。這些結(jié)果表明,木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶這兩種酶對(duì)牡丹籽粕蛋白的水解能力較弱,而復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶較為適合酶解牡丹籽蛋白。堿性蛋白酶能特異性催化疏水性氨基酸的水解,而復(fù)合蛋白酶則作用廣泛,二者較適合催化牡丹籽粕蛋白的水解,說明牡丹籽粕蛋白中含有大量的疏水性氨基酸,如丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸等,這與龐雪飛等[15]的研究結(jié)果相符。

圖1 不同蛋白酶酶解對(duì)牡丹籽粕多肽水解度(A)和DPPH自由基清除率(B)的影響Fig.1 Effects of proteases on hydrolysis degree A,DPPH free radical scavenging rate B of peptides prepared from peony seed meal

圖1B結(jié)果表明,分別用5種蛋白酶酶解牡丹籽蛋白，基中經(jīng)堿性蛋白酶酶解后得到的多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng),且水解度高;經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后得到的多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng),但水解度太低,制備得到的多肽量很少,蛋白的利用率極低,浪費(fèi)嚴(yán)重。綜合考慮水解度和DPPH自由基清除能力,堿性蛋白酶是水解牡丹籽粕蛋白制備抗氧化肽的最適宜蛋白酶,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究將選用堿性蛋白酶對(duì)牡丹籽粕蛋白進(jìn)行酶解。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 底物濃度對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的影響 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度和DPPH自由基清除能力的影響差異極顯著(p<0.01),結(jié)果如圖2所示。隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,水解度與清除率都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到最大為50.83%,此時(shí)水解度為5.67%;底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%～2%時(shí),清除率和水解度變化不大;之后二者都顯著降低。該變化趨勢(shì)可能是因?yàn)榈孜餄舛冗^大,導(dǎo)致有效濃度降低,反應(yīng)體系的粘度增大,酶與底物不能充分接觸反應(yīng),導(dǎo)致水解度與清除率都降低[21]。因此,選擇0.5%、1%和1.5% 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖2 底物濃度對(duì)酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of substance concentrations on DH and DPPH free radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的影響 酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除能力的影響差異極顯著(p<0.01),結(jié)果如圖3所示。隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng),牡丹籽粕蛋白的水解度先增加,酶解2.5 h時(shí)達(dá)最高值,然后趨于穩(wěn)定;DPPH清除率在酶解2 h時(shí)達(dá)最大值為51.34%,而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)清除率反而降低,推測(cè)原因可能是由于蛋白酶解過程是逐步進(jìn)行的,具有DPPH自由基清除活性的肽段部分被酶解,導(dǎo)致活性降低。多肽的抗氧化活性在于其含有能與自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán),即供氫基團(tuán),只有這些多肽在適當(dāng)?shù)姆肿恿繒r(shí),這些特定的供氫基團(tuán)才能夠最大限度地接觸自由基,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性[22]。因此,選擇酶解時(shí)間1.5、2、2.5 h進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of hydrolysis time on DH and DPPH free radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.3 加酶量對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的影響 加酶量對(duì)水解度和DPPH自由基清除能力的影響差異極顯著(p<0.01),結(jié)果如圖4所示。DPPH自由基清除率隨加酶量的增加而增大,當(dāng)加酶量達(dá)到5%時(shí),清除率達(dá)到最大,之后呈降低趨勢(shì)。清除率下降的原因可能是過量的酶催化可使具有抗氧化活性的肽段進(jìn)一步水解,失去活性。因此,選擇加酶量4%、5%、6%三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖4 加酶量對(duì)酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of enzyme dosage on DH and DPPHfree radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.4 酶解溫度對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的影響 酶解溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除能力的影響差異顯著(p<0.05),結(jié)果如圖5所示。隨著溫度的升高,酶解物的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),原因可能是溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶活力降低甚至失活[23]。在溫度為55 ℃時(shí),清除率達(dá)到最高,而此時(shí)的水解度卻最低為5.65%;55～65 ℃時(shí),酶解度升高,水解度與清除率的變化趨勢(shì)不一致。相關(guān)研究表明,酶解產(chǎn)物的抗氧化性與水解度有一定的關(guān)系,但并不是水解度越高,抗氧化性就越強(qiáng),相對(duì)較高水解度的蛋白水解產(chǎn)物可能含有電子供體物質(zhì),可與自由基反應(yīng),將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的產(chǎn)物并終止自由基鏈反應(yīng)[24]。研究抗氧化肽的工藝條件,我們應(yīng)以酶解產(chǎn)物的抗氧化性作為響應(yīng)值,而不能只簡(jiǎn)單地提高水解度,所以選擇50、55、60 ℃三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖5 酶解溫度對(duì)酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of temperature on DH and DPPHfree radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.5 pH對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的影響 酶解pH對(duì)水解度和DPPH自由基清除能力的影響差異極顯著(p<0.01),結(jié)果如圖6所示。隨著pH的升高,DPPH自由基清除率先升高后降低;當(dāng)pH8.0～9.0時(shí),清除率升高較緩慢,在pH為9.0時(shí)達(dá)最大。較高pH條件下進(jìn)行酶解,反應(yīng)體系中需加入較多的NaOH,NaOH可與反應(yīng)過程中生成的酸中和生成鹽,使得產(chǎn)品中鹽分含量較高,在進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定前需增加脫鹽工序,造成成本增加。所以,制備活性肽時(shí)選用的最適酶解pH為8.0,而不選擇pH9.0作為響應(yīng)面分析的因素。

圖6 pH對(duì)酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of pH value on DH and DPPH free radical scavenging activity of hydrolysates

通過上述各單因素對(duì)制備活性肽的影響的分析表明,牡丹籽粕蛋白酶解產(chǎn)物的水解度與抗氧化能力之間并不存在線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)旨在研究利用牡丹籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝條件。因此,在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)只選用DPPH自由基清除率作為響應(yīng)值。

2.3 酶解工藝參數(shù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)模型分析 響應(yīng)面分析結(jié)果見表3,表中1～24號(hào)是析因?qū)嶒?yàn),25～29號(hào)是中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),其中析因點(diǎn)為自變量,取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合分析,得到二次多項(xiàng)回歸模型為:DPPH自由基清除率Y(%)=52.15-0.67A-1.36B+0.34C-0.65D-0.018AB-0.36AC+0.62AD-1.11BC+0.31BD+0.023CD-4.44A2-1.38B2-3.29C2-1.19D2。

表3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

2.3.2 兩因子交互作用分析 各因子交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的響應(yīng)面三維和等值線如圖7所示。結(jié)果表明,在所選范圍內(nèi)存在極值,它是響應(yīng)曲面的最高點(diǎn),也是等值線圖中最小橢圓的中心。

圖7(A～F)表明,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響最為顯著,曲面較陡;其次是酶解時(shí)間和加酶量;酶解溫度對(duì)其影響最小,曲面平緩。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間,加酶量與酶解時(shí)間,酶解溫度與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的交互作用較為顯著,等值線圖中呈現(xiàn)橢圓。

圖7 任意兩變量交互作用對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plots for the synergetic effects of any two variables on DPPH radical scavenging activity

2.3.3 最佳酶解條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行解析,得出酶解蛋白的最佳工藝條件即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%、加酶量4.63%、酶解時(shí)間1.95 h、酶解溫度56 ℃、pH8.0。根據(jù)實(shí)際的操作條件,將酶解牡丹籽蛋白制備抗氧化肽的最佳條件優(yōu)化為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%、加酶量4.60%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度56 ℃、pH8.0,在此條件下進(jìn)行4次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果測(cè)得酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率為(52.49%±0.2768%)。通過實(shí)驗(yàn)獲得的自由基清除率52.49%與理論預(yù)測(cè)值52.74%的誤差小于1%,驗(yàn)證了該模型的有效性。

2.3.4 牡丹多肽粉氨基酸組成 通過對(duì)牡丹多肽粉進(jìn)行17種水解氨基酸組成分析,可以看出氨基酸種類齊全,其中必需氨基酸含量較高,占總氨基酸量的32.24%,人體需要量最大的亮氨酸和賴氨酸含量較多,表明牡丹多肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;17種水解氨基酸中谷氨酸含量最高,胱氨酸的含量最低,是牡丹籽多肽粉的第一限制氨基酸;異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸含量占總氨基酸的32.24%。

表5 牡丹多肽粉氨基酸組成分析Table 5 Analysis of amino acid composition of peony peptides

3 結(jié)論

選用5種蛋白酶對(duì)牡丹籽粕蛋白進(jìn)行酶解,以蛋白水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo),篩選確定堿性蛋白酶為水解牡丹籽粕蛋白的最佳酶源,并得出酶解產(chǎn)物的抗氧化性與水解度有一定的關(guān)系,但并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系;水解度越高,抗氧化性不一定越強(qiáng)。通過單因素和響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到采用堿性蛋白酶水解牡丹籽粕蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%、加酶量4.60%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度56 ℃、pH8.0,該條件下通過實(shí)驗(yàn)獲得的DPPH自由基清除率為52.49%,與理論預(yù)測(cè)值52.74%的誤差小于1%。對(duì)制備得到的牡丹多肽粉進(jìn)行17種水解氨基酸組成分析,可以看出氨基酸種類齊全,其中必需氨基酸含量較高,占32.24%,表明牡丹多肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。該研究利用新食品資源油用牡丹籽粕蛋白作為原料開展制備抗氧化肽的研究,提高了牡丹籽粕的利用率,為牡丹籽粕的精深加工開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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