酶解制備豬小腸粘膜蛋白粉工藝條件優化

葛慶豐,丁祺祺,陳 勝,楊祥凡,尹永祺,賈鐵平,吳滿剛,于 海,*

(1.揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127;2.江蘇省淮揚菜產業化工程中心,江蘇揚州 225127;3.江蘇萬力生物科技有限公司,江蘇東臺 224200)

豬腸膜蛋白(dried porcine soluble,DPS)是一種營養性動物蛋白原料,由豬腸膜水解制得[1]。DPS具有小肽及游離氨基酸含量豐富、動物吸收利用率高及適口性好等營養特性,研究發現,日糧中添加DPS粉可顯著提高仔豬日增重、減少斷奶應激并降低死亡率[2]。因此,目前DPS粉已被廣泛用于動物生產中，尤其是仔豬斷奶及保育階段日糧生產[3]。

由于化學水解法難以控制豬腸膜水解程度、易破壞氨基酸結構且需去除酸堿溶劑,而酶解豬腸膜法不僅可保持原料蛋白營養價值而釋放出不同鏈長的生物活性肽,同時生產成本及污染程度低,其已成為DPS粉制備工藝中的研究熱點[4-7]。舒夏娃采用雙酶分段水解工藝,得到水解腸粘膜最佳工藝參數,制備出低分子肽含量較高的腸粘膜蛋白粉產品[8]。王春維等[9]初步研究了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對豬腸粘膜水解效果,實驗結果表明木瓜蛋白酶優于胰蛋白酶,酶解工藝條件為:水解時間7 h,溫度60 ℃,酶加量2%。目前國內外豬腸膜的研究開發較少,對酶解制備工藝優化方面沒有進行深入探討。

在我國眾多肝素生產企業中,腸粘膜提取肝素后的下腳料一般作為廢棄物隨污水直接排放[10],不僅造成蛋白資源的大量浪費,而且由于傳統的生產工藝,會產生腥臭、污水,污染環境[11]。近幾年來,選用生物價值不高的副產物及食品工業的廢水、廢物為原料,制備一系列功能各異的生物活性物質已經成為食品領域的研究趨勢。腸粘膜作為腸衣生產加工過程中的副產物,富含蛋白質,蛋白質總量高達60%,具有極高的研究價值[9]。因此,本實驗以天然腸衣加工副產物腸粘膜為原料,以產品可溶性蛋白含量為指標,通過響應面分析法優化腸粘膜蛋白粉的制備工藝參數,篩選適合用于酶解腸粘膜的蛋白酶,旨在實現動物副產資源的循環利用,從源頭減量排放減少環境污染,節約飼料生產成本,推動腸粘膜蛋白粉在國內飼料中的廣泛應用,產生巨大經濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸粘膜(腸衣加工過程中的廢棄物) 江蘇聯眾腸衣有限公司;木瓜蛋白酶(酶活>1000 U/mg),胰蛋白酶(酶活>250 U/mg),胃蛋白酶(酶活>3000 U/mg) 上海藍季生物有限公司;鄰苯二甲醛、甲醇、十二烷基硫酸銨(SDS)、β-巰基乙醇、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉 國藥集團化學試劑有限公司,所有試劑均為國產分析純試劑。

INFINITE 200 PRO酶標儀 瑞士Tecan集團有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SX-500自動蒸汽消毒柜 日本TOMY公司;W201恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術有限公司;BCD-215DF電冰箱 青島海爾股份有限公司;Sorvall ST 16R高速冷凍離心機 德國Thermo Fisher科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腸粘膜蛋白粉的制備 稱取一定質量腸粘膜溶于緩沖液中,1×104r/min勻漿10 s,根據不同蛋白酶最適水解條件對腸粘膜進行水解,水解結束后沸水浴滅活5 min,4000 r/min離心15 min,取上清液冷凍干燥,最后在干燥皿中保存腸粘膜蛋白粉。

1.2.2 可溶性蛋白含量測定 用福林-酚法測定腸粘膜可溶性蛋白含量[12]。

1.2.2.1 標準曲線的制作 配制標準蛋白質溶液:稱取250 μg牛血清蛋白,溶于1 mL蒸餾水中,配成250 μg/mL的牛血清蛋白溶液。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準蛋白液于帶塞試管中,再分別加入蒸餾水到1 mL。每個試管各加5.0 mL試劑甲,混勻后室溫放置10 min,加入0.5 mL試劑乙,立即混勻,室溫反應30 min,在600 nm處測吸光值,以OD600為縱坐標,蛋白含量為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程:y=1.2602x+0.8106,R2=0.9985。

1.2.2.2 可溶性蛋白含量的計算 取0.5 mL酶解液,按照標準曲線制作步驟操作,由回歸方程計算得到對應的牛血清蛋白的數量從而得到可溶性蛋白含量。

樣品中蛋白含量(%)=[X(μg/mL)×樣品總體積(mL)×100]/[樣品重量(g)×106]

1.2.3 蛋白酶篩選 選擇木瓜蛋白酶,胰蛋白酶和胃蛋白酶對腸粘膜進行水解,以可溶性蛋白含量為評價指標篩選合適蛋白酶,具體水解條件如表1所示。

表1 蛋白酶的選擇Table 1 The choice of protease

1.2.4 水解工藝優化

1.2.4.1 單因素實驗 在篩選出最適蛋白酶基礎上,保持其他條件不變,分別研究水解時間、蛋白酶添加量和液固比對酶解液中可溶性蛋白質含量的影響。

水解時間:固定液固比為3 mL/g,蛋白酶添加量為5000 U/g蛋白,分別水解3、4、5、6、7、8 h,測定可溶性蛋白含量。

蛋白酶添加量:固定液固比為3 mL/g,水解時間為6 h,蛋白酶添加量分別為1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g蛋白,測定可溶性蛋白含量。

液固比:固定水解時間6 h,蛋白酶添加量為5000 U/g蛋白,液固比分別為1、2、3、4、5、6 mL/g,測定可溶性蛋白含量。

1.2.4.2 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,采用3因素3水平的Box-Behnken[13-14]設計,考察水解時間、酶添加量和液固比3個因素對可溶性蛋白質含量的影響,實驗因素水平見表2,以可溶性蛋白質含量為響應值,通過響應曲面法優化酶解條件,采用Design-expert 8.0.6對實驗數據進行回歸分析,建立二次線性回歸方程,預測最佳工藝參數[15-17]。

表2 Box-Behnken實驗設計因素水平表Table 2 Variables and their levels and actualvalues employed in Box-Behnken design

1.3 數據分析

各指標測定重復3次,結果以“平均值±標準差”表示。使用SigmaPlot軟件繪制散點圖,使用DPS軟件進行顯著性分析和標準差分析,運用Design-Expert 8.0.6軟件設計并進行響應面實驗數據分析。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

蛋白酶具有特異性、專一性的特點,因此不同蛋白酶對腸粘膜的水解效果不同[18]。由圖1可以看出,木瓜蛋白酶制備得到的腸粘膜蛋白粉可溶性蛋白含量為7.37%±0.06%顯著高于(p<0.05)胰蛋白酶和胃蛋白酶;木瓜蛋白酶屬于半胱氨酰基蛋白酶,能夠降解膠原纖維和結締組織蛋白質,將肌動蛋白和膠原蛋白降解成為小分子的多肽[19],其在肉類食品中的應用十分廣泛[20]。因此選用木瓜蛋白酶進行后續實驗。

圖1 不同蛋白酶對可溶性蛋白含量的影響Flg.1 Effects of different protease on soluble protein content

2.2 木瓜蛋白酶酶解單因素實驗

2.2.1 水解時間對可溶性蛋白含量的影響 如圖2所示,隨著水解時間的延長,酶解液中可溶性蛋白含量逐漸增加,水解7 h時,其可溶性蛋白含量最高為15.20%±0.04%,隨后緩慢降低。這是因為水解初期階段,底物和蛋白酶充分酶解,酶解產物的可溶性蛋白含量增加;隨水解時間延長,酶解液中肽鍵進一步斷裂,導致可溶性蛋白含量降低。賈韶千等[21]以DPPH自由基清除率為指標研究水解時間對黃鱔魚多肽水解效果的影響,發現水解時間延長,水解反應中的一些肽段被再次水解,導致水解效果降低。選擇水解時間7 h作為最適水解時間。

圖2 水解時間對腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.2 Effects of hydrolysis time on the soluble protein content of intestinal mucosa

2.2.2 酶添加量對可溶性蛋白含量的影響 如圖3所示,隨著木瓜蛋白酶添加量的增加,腸粘膜可溶性蛋白含量增加,這是因為酶添加量越多,底物反應越徹底,酶添加量為5000 U/g蛋白時,可溶性蛋白含量最大為15.59%±0.05%。繼續添加蛋白酶時,底物已經充分水解,可溶性蛋白含量反而下降,可能因為是繼續增加酶添加量,導致酶自身水解,酶活力降低,進而影響可溶性蛋白含量[22]。程水明等[23]在木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白工藝的優化一文中指出,酶添加量過高時,由于酶本身的相互水解作用加強,會抑制酶對底物的水解;當酶添加量較小時,主要為酶控反應,隨著酶添加量的增加,水解效果會越好。因此選擇酶添加量5000 U/g進行響應面實驗。

圖3 酶添加量對腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.3 Effects of enzyme addition on soluble protein content of intestinal mucosa

2.2.3 液固比對可溶性蛋白含量的影響 如圖4所示,隨著液固比的增加,腸粘膜可溶性蛋白含量增加,這是因為底物濃度較低時,只有一部分酶與底物結合,隨著底物濃度增加,酶與底物充分反應,中間產物增多;當液固比較大時,使得蛋白酶有效濃度降低,從而不利于蛋白水解。趙世光等[24]研究液固比酶法制備芝麻多肽的影響,發現多肽產率達到最高值時繼續增加液固比后,多肽產率增幅不明顯。液固比能反應溶質在溶劑中的溶解狀況,液固比較小時,反應體系黏度大,不利于蛋白酶與腸粘膜蛋白組分的接觸,水解反應受到抑制,水解效果不佳;液固比較大時,降低了體系的黏度,促進了酶與蛋白之間的作用,可溶性蛋白含量增加。因此最適液固比為4 mL/g。

圖4 液固比對腸粘膜可溶性蛋白含量的影響Flg.4 Effects of liquid quality on soluble protein content of intestinal mucosa

2.3 酶解條件響應面實驗

2.3.1 響應面模型的建立與方差分析 根據單因素實驗結果,選擇水解時間、酶添加量、液固比3個因素為變量,可溶性蛋白含量為響應值,設計3因素3水平的響應面實驗。

Box-Behnken實驗設計組合及結果見表3。利用Design Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合,得到描述酶解液中可溶性蛋白含量(Y)與自變量酶解時間(A)、酶添加量(B)和液固比(C)的二次多項回歸擬合方程:

表3 響應面實驗設計與結果Table 3 Response surface test design and results

Y=15.42-0.30A+0.64B-1.21C-.090AB-0.59AC+0.10BC-0.71A2-1.26B2-2.14C2。

由表4可知,B、AB、AC、A2、B2和C2項的F檢驗呈顯著性,模型的p值顯著,且失擬項不顯著,說明方程的擬合是充分的,相關系數R2=0.9714,說明預測值與實測值之間具有較高的相關性,所以此模型能夠描述木瓜蛋白酶酶解條件對腸粘膜的水解變化規律,能較好的優化實驗方案。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Regression model variance analysis

2.3.2 響應曲面分析及優化 根據響應面數據回歸分析所得的二次回歸方程,作出響應面圖和等高線圖,可在實驗范圍內分析各變量之間的變化關系(圖5～圖7)。

圖5為固定液固比4 mL/g,酶添加量和水解時間對腸粘膜可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著酶添加量的增加和水解時間的延長,可溶性蛋白的含量升高,其中,酶添加量對可溶性蛋白含量的影響較大。酶添加量在-0.5～1水平,水解時間在-1～0.5水平范圍內,可溶性蛋白含量可獲得最大值。

圖5 酶添加量和水解時間對腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應曲面圖Flg.5 The contour map and 3D response surface map of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by enzyme addition and hydrolysis time

圖6為固定水解時間7 h,液固比和酶添加量對可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著液固比和酶添加量的增加,可溶性蛋白的含量先升高后下降,其中,液固比對可溶性蛋白含量的影響較大。液固比在-1～0.5水平,可溶性蛋白含量隨液固比增大而迅速增加,之后可溶性蛋白曲面緩慢下降。由等值線可見,液固比在-0.8～0.3水平,酶添加量在-0.5～1水平范圍內,可溶性蛋白含量有最大值。

圖6 液固比和酶添加量對腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應曲面圖Flg.6 The contour map and 3D response surface map of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by liquid ratio and enzyme

圖7為固定酶添加量5000 U/g蛋白,液固比和水解時間對可溶性蛋白含量的影響。由圖所示,隨著液固比和酶添加量的增加,可溶性蛋白的含量先升高后下降,其中,水解時間對可溶性蛋白含量的影響較小[25-26]。

圖7 液固比和水解時間對腸粘膜可溶性蛋白影響的等值線圖和3D響應面圖Flg.7 The contour map and 3D response surface of the soluble protein of intestinal mucosa were affected by the liquid ratio and hydrolysis time

由響應面軟件分析預測得到最大的響應值(Y)時,因子A、B、C對應的編碼值分別為A=6.56、B=5372.12、C=1∶3.78,其所對應的木瓜蛋白酶生產腸膜蛋白粉的最佳工藝為:酶添加量為5372.12 U/g蛋白,水解時間為6.65 h,液固比為3.78 mL/g,可溶性蛋白含量最高為15.92%。

為了檢驗響應面法的可行性,采用得到的最佳酶解條件并考慮實際操作,修正工藝條件為:酶添加量5400 U/g蛋白,水解時間6.5 h,液固比4 mL/g,得到實驗可溶性蛋白含量為15.81%±0.04%,與理論值相差0.75%。因此,響應面法對腸粘膜蛋白粉生產工藝進行優化具有可行性。

3 結論

以可溶性蛋白含量為指標,確定木瓜蛋白酶為最適用酶。在此基礎上,通過單因素實驗和響應面設計分析優化木瓜蛋白酶酶解豬小腸粘膜的工藝條件。確定最佳腸粘膜蛋白粉制備條件為:水解時間6.5 h、酶添加量5400 U/g、液固比為4 mL/g,在此條件下得到的水解產物可溶性蛋白含量為15.81%±0.04%。結果表明本實驗方法對天然腸衣加工副產物-腸粘膜的利用開發具有參考價值。

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