植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠免疫調節作用初步研究

蒙月月,sathi Chowdhury,shuvan kumar sarker,霍貴成

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

免疫是機體識別自我物質和排除異己物質的復雜的生物學反應,是在長期進化中所形成的一種保護性生理功能[1]。很多疾病和一些常見傳染病在發病機理以及防治等方面都與機體的免疫機能息息相關[2]。研究表明,益生乳酸菌可刺激腸道局部免疫反應,提高機體抗體水平或巨噬細胞的活性,從而增強機體的免疫功能。但具體調節機制尚不清楚,并且這種調節作用具有菌株特異性[3]。隨著人們對益生菌的關注,越來越多的研究證明益生菌作為一類食品級的微生物菌群,在防癌、抗腫瘤及增強免疫功能等方面發揮重要作用[4-5]。

我國是最早利用乳酸菌發酵食品的國家之一[6],擁有豐富的傳統發酵食品,蘊藏著大量的乳酸菌資源。其與雙歧桿菌屬的不同物種,及其它一些微生物物種作為益生菌廣泛應用[7],存在于機體腸道中并在食品中廣泛應用的乳桿菌種主要有:卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgassed)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[8]。

植物乳桿菌主要存在于奶油、肉類及蔬菜發酵制品中[9],由于大部分菌株從植物中分離得到,因此得名植物乳桿菌。其菌落形狀獨特,有桿狀和鏈狀[10]。植物乳桿菌能發酵大部分糖類物質如果糖、核糖和葡萄糖酸等[11],而且大部分反應特性呈陰性如接觸酶、VP反應等。相比于其他乳酸菌,植物乳桿菌活菌數較高,產酸性能好,能夠維持穩定pH[12]。植物乳桿菌KLDS 1.0318是本實驗室保藏的一株益生菌,研究表明,它對于離體小鼠的免疫細胞活性具有良好的促進作用[13]。為了進一步研究其對體內免疫調節作用的影響,本實驗選用健康的BALB/c小鼠為實驗動物,通過評價植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠免疫臟器指數和免疫細胞的調節作用,為其進一步深入開發研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0318 東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室分離純化并保藏;BALB/c小鼠,雌性,清潔級,6～8周齡,初始體重18～20 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK2012-0001;Man-Rogosa-Sharp(MRS)液體培養基;RPMI-1640培養液 美國Hyclone公司;胎牛血清 Vitrocell公司;刀豆蛋白(ConA)、臺盼藍染色液、中性紅染色液、紅細胞裂解液、Hank’s液 Solarbio公司;CellCountingKit-8(CCK-8試劑盒) 日本同仁化學研究所;蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖等均為生化分析純。

DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HF90型CO2培養箱 香港力康發展有限公司;Model 680型酶標儀 美國Beckman公司;PL2002型及AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;20～200、100～1000 μL可調定量移液槍 德國Eppendorf公司;96孔培養板 美國NEST公司;AE-30倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司;VD-1320型潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;LD4-2型低速離心機 北京醫用離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRS液體培養基的配制 具體配制方法參照文獻[14]。

1.2.2 乳酸菌的制備及劑量選擇 將實驗菌株以2%的接種量接種至MRS培養基中,37 ℃培養至生長穩定期(16 h),將菌液在4 ℃條件下5000 r/min離心10 min后,用無菌0.01 mol/L、pH7.4 PBS重懸菌沉淀,重復兩次,棄去上清液,再用PBS調整活菌數為1×109CFU/mL的菌液,每組每天灌胃活菌液1次,灌胃周期為20 d。高劑量組:1×109CFU/只(該劑量為人體推薦劑量的10倍);中劑量組:1×108CFU/只;低劑量組:1×107CFU/只。

1.2.3 動物分組及飼養方式 40只BALB/c小鼠,雌性,在動物房中適應性飼養3 d后待體重均達(20±2) g,將小鼠隨機分為4組,每組10只,分別為正常對照組、乳桿菌高劑量組、乳桿菌中劑量組、乳桿菌低劑量組。每組每天于上午10:00進行灌胃1次,灌胃周期為20 d,鼠房保持飼養環境溫度(23±2) ℃,每天人工燈光照明12 h,所有小鼠飼喂基礎日糧,自由飲水。最后一次灌胃后第二天,摘除眼球采血處死小鼠。

1.2.4 免疫指標測定方法

1.2.4.1 免疫器官指數的測定 灌胃結束后,斷頸椎處死小鼠,迅速取出脾臟和胸腺,將周圍組織剝離干凈,用濾紙吸凈組織表面血液使用電子天平進行稱重。按下式計算免疫器官指數(immune organs index,IOI)[15]:

1.2.4.2 脾淋巴細胞增殖活性的測定 (a)小鼠脾細胞懸液制備:以頸椎脫臼法處死小鼠,用75%乙醇浸泡小鼠3～5 min,沿腹腔中線剪開小鼠胸腔,取出脾臟置于培養皿中,剪去脂肪和筋膜組織,用RPMI1640培養液漂洗,用注射器芯輕輕擠壓,用200目尼龍網過濾到玻璃離心管中,用無菌PBS 1500 r/min離心5 min洗滌細胞2次,加入紅細胞裂解液到洗過的細胞中,靜置2 min,以除去血紅細胞,再用RPMI1640培養液離心洗滌細胞2次。將上述收集到的脾臟細胞置于玻璃培養瓶中,在37 ℃、5% CO2培養箱中靜止培養24 h,以除去貼壁細胞,收集未貼壁的細胞懸液即獲得脾臟淋巴細胞。計數接種培養,臺盼藍染色計數,活細胞數應大于95%,最后以完全RPMI-1640培養基調節脾細胞數為1×106個/mL備用[16]。

(b)ConA誘導的脾細胞增殖實驗:在96孔培養液板上加200 μL/孔脾細胞懸液,同時加20 μL/孔ConA(終濃度為5 μg/mL),細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h[17],加入20 μL/孔CCK-8溶液,繼續培養4 h,振蕩混勻;然后在酶標儀上450 nm處測定各孔吸光值。

1.2.4.3 NK細胞活性實驗 (a)效應細胞制備:按照1.2.4.2(a)的方法制備脾細胞,用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度為1×106個/mL備用。(b)靶細胞的制備:以YAC-1細胞作為靶細胞,將已傳代的靶細胞用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度為1×104個/mL備用。(c)NK細胞活性檢測:將脾細胞(效應細胞)和靶細胞各100 μL/孔接種于96孔板,作為反應對照孔(C),效應細胞孔(B)加效應細胞和RPMI-1640完全培養液各100 μL,靶細胞自然釋放孔(A)加靶細胞和RPMI-1640完全培養液各100 μL,以加入無血清的RPMI-1640培養液200 μL作為對照孔(調零孔)。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養20 h,加入15 μL/孔CCK-8溶液,繼續培養4 h,振蕩混勻;之后用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光值[18-19]。按下列方式計算NK細胞活性:NK細胞活性(%)=(A+B-C)/A×100

1.2.4.4 腹腔巨噬細胞吞噬能力的測定

(a)腹腔巨噬細胞的制備:小鼠眼球放血,頸椎脫白處死后,置于75%乙醇溶液中浸泡3～5 min以消毒皮膚,暴露出腹膜壁,酒精擦洗腹部后,用無菌注射器抽10 mLHank’s液,注入腹腔中,敲打輕柔2 min,使腹腔巨噬細胞盡可能多地懸浮在液體中;另取一支注射器抽出腹腔懸液,收集于無菌離心管中,1000 r/min離心5 min,棄上清液;用RPMI-1640完全培養液吹打細胞使其成為單細胞懸液,血球計數板計數,確保活細胞比例不小于95%,調整細胞濃度為1×106個/mL用于實驗[20]。

(b)巨噬細胞吞噬中性紅能力測定:將巨噬細胞接種于96孔板(100 μL/孔),細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 h,棄去上清液,貼壁細胞即為巨噬細胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培養液100 μL。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,棄去上清液,加入0.072%中性紅溶液100 μL/孔,繼續培養30 min,棄去中性紅溶液,用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性紅,之后加入200 μL/孔細胞裂解液(冰醋酸∶無水乙醇=1∶1,v/v),繼續培養2 h,振蕩混勻,用酶標儀在540 nm處測定吸光值[21]。

1.2.4.5 腹腔巨噬細胞能量代謝水平的測定 按照1.2.4.4(b)的方法接種巨噬細胞,細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后,加入20 μL/孔CCK-8溶液,繼續培養2 h,振蕩混勻;然后在酶標儀上450 nm處測定各孔吸光值。結果以OD值表示腹腔巨噬細胞能量代謝水平[22]。

1.3 統計分析

所有實驗均進行3次重復實驗,采用Excel 2010軟件處理實驗數據及制圖,并用統計軟件包SPSS 22對實驗結果進行顯著性分析。實驗數據以均數±標準差(X±S)表示,p<0.05認為差異有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 對小鼠免疫器官指數的影響

小鼠的脾臟和胸腺重量增加,臟器指數變大,可以間接判斷乳桿菌對機體免疫功能的影響。因而脾臟及胸腺指數可以作為反映機體免疫力情況的重要指標之一。分別給小鼠灌胃低、中、高劑量的乳酸菌,在第21 d摘取小鼠脾臟和胸腺,稱重,計算免疫器官指數,結果見表1。由表中數據可以看出:低劑量組和中劑量組的脾臟指數與正常對照組相比無顯著差異(p>0.05),而高劑量組比對照組提高了11.0%,差異顯著(p<0.05)。乳酸菌三個劑量組的胸腺指數與正常對照組相比均差異顯著(p<0.05),其中高劑量組提高了42.2%。實驗結果表明,高劑量的植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠提高小鼠的脾臟及胸腺指數。

表1 植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響Table 1 The effect of Lactobacillus plantarumKLDS 1.0318 on spleen and thymus index in mice

2.2 小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

脾淋巴細胞中含有機體的免疫活性細胞:T、B淋巴細胞,它們是免疫系統結構和功能的核心,既負責介導機體的細胞免疫應答,又能夠調節機體其他免疫細胞的功能[23]。其增殖的高低可以反映出機體的細胞免疫水平。

本實驗以健康小鼠為研究對象,評估植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響,結果如圖1所示。由圖中數據可以看出:與正常對照組相比,中劑量組和高劑量組能夠促進脾淋巴細胞增殖,差異顯著(p<0.05),吸光值分別增加了38.4%和76.2%。而低劑量組與正常對照組的吸光值無顯著差異(p>0.05)。分析結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318可以提高小鼠脾淋巴細胞轉化能力,具有體內免疫活性。

圖1 植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effects of Lactobacillus plantarum KLDS 1.0318 on proliferation of spleen lymphocytes in mice注:相同字母表示組間沒有顯著性差異,不同字母之間表示組間存在顯著差異(p<0.05),圖2～圖4同。

2.3 對小鼠NK細胞活性的影響

NK細胞是淋巴細胞細胞毒性的主要代表細胞群,在抗腫瘤和抗病毒免疫過程中起重要作用。植物乳桿菌KLDS 1.0318各劑量組對小鼠NK細胞活性的影響如圖2所示,圖中數據表明:與正常對照組小鼠相比,乳酸菌各劑量組均能不同程度提高小鼠的NK細胞活性,且差異顯著(p<0.05)。實驗結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318可以提高正常小鼠NK細胞活性,具有體內免疫活性。

圖2 植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠NK細胞活性的影響Fig.2 Effects of Lactobacillus plantarum KLDS 1.0318 on NK cell activity in mice

2.4 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

巨噬細胞是機體發揮非特異性免疫反應的主要免疫細胞,參與機體免疫系統的第一道防線,因此,小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標之一。本實驗采用中性紅吞噬實驗檢測了植物乳桿菌KLDS 1.0318對健康小鼠巨噬細胞吞噬作用的影響,結果如圖3所示。由圖中數據可以看出:與正常對照組小鼠相比,中、高劑量的植物乳桿菌均能明顯提高巨噬細胞吞噬中性紅能力,差異顯著(p<0.05),低劑量組與對照組的吞噬能力差異不顯著(p>0.05),分析結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318具有體內免疫活性,能夠增強巨噬細胞吞噬功能,并呈現有劑量依賴關系。

圖3 植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.3 Effects of Lactobacillus plantarum KLDS 1.0318 on uptake by mice peritoneal macrophages

2.5 對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響

植物乳桿菌KLDS 1.0318的不同劑量對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響如圖4所示。由圖中數據可以看出:乳酸菌各劑量組小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平均有不同程度的提高,低劑量組與正常對照組比較差異不顯著(p>0.05),中、高劑量組的光密度值與正常對照組相比分別提高了44.8%和66.0%,差異顯著(p<0.05)。分析結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318具有體內免疫活性,能夠增強巨噬細胞能量代謝水平,并呈現有劑量依賴關系。

圖4 植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.4 Effects of Lactobacillus plantarum KLDS 1.0318 on energy metabolism of peritoneal macrophages in mice

3 結論與討論

脾臟和胸腺均是機體主要的免疫器官,其中脾臟是機體最大的外周淋巴器官,是B淋巴細胞的主要定居地,參與機體體液免疫。而胸腺屬于中樞免疫器官,是T淋巴細胞分化和成熟的場所,主要參與細胞免疫。脾臟和胸腺指數是衡量機體免疫功能的初級指標。免疫增強劑可使脾臟和胸腺質量增加,因此,脾臟和胸腺可以作為衡量機體免疫功能的基礎指標之一[24],胸腺和脾臟指數能有效的反映免疫器官的發育和免疫細胞的功能狀況,從而間接反映機體的免疫水平。托婭[25]通過研究表明,乳桿菌Lb.caseiZhang活菌中、高劑量組能夠明顯增加小鼠脾臟指數,從而具有提高小鼠機體免疫機能的功效。謝俊華[26]通過體內實驗研究,發現植物乳桿菌NCU116能顯著提高免疫低下小鼠的脾臟指數和胸腺指數,同時有效地增加小鼠免疫細胞的數量,提高細胞因子的分泌水平及相應的mRNA表達水平。本研究中,植物乳桿菌KLDS 1.0318低劑量組和中劑量組的脾臟指數與正常對照組相比無顯著差異(p>0.05),但高劑量組能夠明顯提高小鼠脾臟指數。乳酸菌各劑量組的胸腺指數與正常對照組相比均差異顯著(p<0.05)。表明了植物乳桿菌KLDS 1.0318具有提高小鼠機體免疫機能的功效。

淋巴細胞增殖實驗是檢測T細胞免疫功能的方法,其增殖率可直接反映細胞免疫功能狀態。T淋巴細胞的激活、分化和增殖在免疫應答過程中起著重要的作用。劉東方[27]利用鼠李糖乳桿菌LV108和短雙歧桿菌XJH301菌懸液及發酵乳對小鼠進行灌胃四周,通過MTT法測定脾淋巴細胞增殖反應,結果表明上述兩株菌菌懸液及發酵乳均能夠促進脾淋巴細胞增殖,顯示出明顯的免疫刺激作用。NK細胞也屬于淋巴細胞,主要存在于外周血和脾中,不依賴抗體也不需要抗原刺激和致敏就能殺傷靶細胞[22]。干酪乳桿菌被發現能夠活化T細胞,促使細胞毒性T細胞(Tc)的產生,增強自然殺傷(NK)細胞的活性,同時能夠調節巨噬細胞-集落形成細胞的增殖過程[28]。本實驗采用CCK-8法,它是用于測定細胞增殖或細胞毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度,無放射性的比色檢測法。結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0318的中、高劑量能夠協同ConA刺激小鼠脾淋巴細胞增殖,同時能夠提高小鼠NK細胞的免疫活性,顯示出一定的免疫促進作用,且與劑量呈正相關。

巨噬細胞是機體重要的免疫調節和效應細胞,在機體許多的生理和病理反應過程中發揮著重要的作用。巨噬細胞能夠吞噬和消除多種病原微生物,并通過胞內溶酶體等消化清除多種致病物質,此外,巨噬細胞還具有較強的抗原處理以及遞呈能力,并能通過分泌多種細胞因子發揮免疫調節和介導炎癥反應,是維持機體內環境穩定的一個重要系統[29]。孫進等[30]分析了植物乳桿菌Lp6對小鼠免疫系統的作用機理,結果表明該菌可以不同程度的增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性。劉佳等[31]研究表明了硒化乳酸菌胞外多糖能夠顯著提高巨噬細胞吞噬活性,有助于機體增強機體免疫反應。本實驗研究結果也證明了植物乳桿菌KLDS 1.0318的中、高劑量能夠顯著提高小鼠巨噬細胞吞噬中性紅能力及其能量代謝水平(p<0.05)。

綜上所述,植物乳桿菌KLDS 1.0318能夠作用于小鼠免疫器官,提高了小鼠的脾臟和胸腺指數,同時能夠增強免疫細胞活性,促進脾淋巴細胞增殖,增強小鼠NK細胞對YAC-1靶細胞的殺傷活性,提高小鼠巨噬細胞吞噬中性紅能力及其能量代謝水平,說明植物乳桿菌KLDS 1.0318可以通過促進機體的特異性免疫和非特異性免疫功能來增強機體的免疫作用。但其對于相關免疫分子、信號通路以及腸道菌群結構的影響還有待深入研究。

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